蒙医针刺疗法治疗干眼症模型大鼠的实验研究*

吴萨日娜，李常胜，吴斯琴毕力格，嘎拉台，新吉夫，桂 芝，刘 彬，何宇红

（1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050）

干眼症是一种常见的眼部疾病，其发病率呈逐年升高趋势[1]，病因复杂，临床表现多种多样。病情发展到一定程度，可明显降低人的视觉，影响患者工作和生活[2]。美国的一项研究表明，全球有10%～15%的成人患有干眼症，其中日本的发病率为17.0%，澳大利亚为10.3%。目前我国还没有确切的干眼症流行病学资料，根据我国的卫生状况和环境状况，干眼的患病率要高于美国[3]。已有研究[4-5]显示，干眼症的发生与患者自身免疫疾病、激素分泌水平降低、细胞过度自噬、炎症反应和细胞凋亡等因素有关。一项研究[6]表明，过度的炎症应激反应是引起干眼症的重要原因。

根据干眼症的临床症状，蒙医将其归属于“寒风赤眼症”范畴。蒙医学认为，人体是由三根（赫依、希拉、巴达干）与七素相互依赖所构成的整体，三根失去平衡是一切疾病发生的根本原因。干眼症是体内因赫依偏胜，并与希拉、巴达干相博，侵袭肝和白脉系统，引发肝、眼血行障碍，阻塞白脉之传导所致。蒙医学认为，干眼症病位在于肝和白脉，肝位于希拉区，也是赫依的主要窜行之道。因此，本课题选取赫依穴、希拉穴和肝穴，而不是干眼症发作密切相关的眼部穴位。蒙医针刺疗法具有镇赫依、调节三根、镇痛、疏通白脉、调整脏腑功能，可以达到抗干眼效果。本研究采用蒙医针刺疗法干预阿托品诱导的干眼症模型大鼠，观察针刺对角结膜炎症因子的干预作用，阐述“调节三根，精充目明”的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，6～8周龄，体质量210～230 g，合格证号：110324210106503772，由苏州西山生物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。动物进驻动物房后适应性喂养1周，期间自由食水，温度（24±2）℃，湿度48%，12 h光照、12 h黑暗。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2 药物与试剂 1%硫酸盐阿托品眼用凝胶（批号210801）、玻璃酸钠滴眼液（批号：ID210502）均由沈阳兴齐眼药股份有限公司生产。Anti-IL-1β antibody（批号：ab234527）、Anti-IL-6 antibody（批号：ab281013）、Anti-TNF-α（批号：2150188）均购自Abcam公司；HRP标记的羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZB-2301），Alexa Fluor 488标记羊抗兔IgG（thermos fisher 公司，批号：R37115）。

1.3 模型制作与针刺干预 大鼠适应性喂养1周后，采用随机数表法进行分组，分为正常组、模型组、玻璃酸钠滴眼液组、蒙医针刺疗法组，每组15只，雌雄各半。除正常组外，其他3组以1%硫酸阿托品眼用凝胶滴眼，每日4次（08:00、12:00、16:00、20:00）、每次每眼5 μL，直至实验结束，共4周。滴药3 d后进行泪液分泌量及泪膜破裂时间（tear break-up time,BUT）检测判断大鼠成模情况，剔除不合格大鼠。成模后，模型组不做处理；玻璃酸钠滴眼液组给予玻璃酸钠滴眼，3次/d，共4周；蒙医针刺疗法组则根据全国针灸学会实验研究学术会制定的“实验动物针灸穴位图谱”选取相当于人体解剖部位的相应穴位，取大鼠赫依穴（第1胸椎下凹正中）、希拉穴（第2胸椎下凹正中）、肝穴（第9胸椎下凹正中）行针刺，1次/d，共4周。

1.4 对泪液质量的影响

1.4.1 泪液分泌量 造模后，使用泪液分泌试纸进行泪液分泌量（Schirmer test，SIT）[7]检测，判断是否成模。针刺后第2、4周再次检测泪液分泌量，判断针刺对大鼠泪液分泌的影响。

1.4.2 泪膜破裂时间测定 造模后，采用荧光素染色法观察大鼠泪膜破裂时间（BUT）[8]，判断是否成模。针刺后第2、4周再次检测BUT，判断针刺对大鼠泪液分泌的影响。

1.5 HE染色法判断大鼠角膜形态学变化 末次针刺2 h后，以过量麻醉法（过量水合氯醛）处死。4 min内，在手术显微镜下与巩膜分离，并完整取下大鼠右眼角膜，4%多聚甲醛固定。对前固定的角膜30%蔗糖脱水，常规石蜡包埋，5 μm连续切片，以备进行HE染色，洗片后滴加苏木素复染细胞核，最后使用盐酸酒精分化后封片观察。

1.6 RT-PCR法检测大鼠角膜组织白细胞介素（interleukin，IL）-1β mRNA、IL-6 mRNA、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-a, TNF-α）mRNA表达水平 采用4组20 mg左右的冰冻角膜。用液氮将试样粉碎，加入1 mL Trizol，在室温下放置2 min，将Trizol转到没有RNA酶的EP管内。添加200 μL的氯仿，大力摇动15 s，室温放置15 min，然后离心（4 ℃，12 000×g，15 min）。离心后，将液体分成三层，取上部无色液体至新的EP管中。加入等体积的异丙醇，将其上下混合，在室温下放置5 min，然后离心（4 ℃，12 000×g，10 min）。去上清，沉淀，加入1 mL 75%的酒精，稍摇15 s，然后离心（4 ℃，7 500×g，5 min）。注意清除上清液，将管道中的沉淀置于超净台中，吹气静置3～5min。提取上清后，用50 μL的DEPC溶解，用UV测定，-80 ℃冷藏。根据反转录试剂盒的指示进行反转录试验。引物序列见表1。

表1 RT-q PCR 引物序列

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism-6统计软件进行数据统计，并且绘制统计图表。计量资料用（）表示，采用One-way ANOVA 及T-test进行检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺干预前后各组SIT检测结果 阿托品滴眼3 d后，与正常组比较，模型组、玻璃酸钠滴眼液组、蒙医针刺疗法组大鼠泪液试纸长度明显缩短（P＜0.01）。针刺干预后2周时，与模型组比较，蒙医针刺疗法组与玻璃酸钠滴眼液组大鼠SIT明显增长（P＜0.01）；与蒙医针刺疗法组比较，玻璃酸钠滴眼液组大鼠SIT明显缩短（P＜0.01）。针刺干预后4周时，与模型组比较，蒙医针刺疗法组与玻璃酸钠滴眼液组大鼠SIT明显增长（P＜0.01）；与蒙医针刺疗法组比较，玻璃酸钠滴眼液组大鼠SIT明显缩短（P＜0.01）；与正常组比较，蒙医针刺疗法组大鼠SIT无明显改变（P＞0.05）。蒙医针刺疗法组4周与蒙医针刺疗法组2周比较，SIT明显增长（P＜0.01）；玻璃酸钠滴眼液组4周与玻璃酸钠滴眼液组2周比较，SIT无明显改变（P＞0.05）。（见图1、表2）

图1 SIT 评分交互效应轮廓图

表2 干预前后各组SIT 比较 （，mm）

注：F时间主效应=431.2，P时间主效应=0.000；F分组主效应=129.5，P分组主效应=0.000；F交互效应=61.98，P交互效应=0.000。

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2.2 针刺干预前后各组BUT检测结果 阿托品滴眼3 d后，与正常组比较，模型组、玻璃酸钠滴眼液组、蒙医针刺疗法组大鼠BUT明显缩短（P＜0.01）。针刺干预后2周时，与模型组比较，蒙医针刺疗法组与玻璃酸钠滴眼液组大鼠BUT明显增长（P＜0.01）；与蒙医针刺疗法组比较，玻璃酸钠滴眼液组大鼠BUT明显缩短（P＜0.01）。针刺干预后4周时，与模型组比较，蒙医针刺疗法组与玻璃酸钠滴眼液组大鼠BUT明显增长（P＜0.01）；与蒙医针刺疗法组比较，玻璃酸钠滴眼液组大鼠BUT明显缩短（P＜0.01）；与正常组比较，蒙医针刺疗法组大鼠BUT明显缩短（P＜0.05）。蒙医针刺疗法组4周与蒙医针刺疗法组2周比较，BUT明显增长（P＜0.01）；玻璃酸钠滴眼液组4周与玻璃酸钠滴眼液组2周比较，BUT无明显改变（P＞0.05）。（见表3、图2）

图2 BUT 评分交互效应轮廓

表3 干预前后各组BUT 比较 （，s）

表3 干预前后各组BUT 比较 （，s）

注：F时间主效应=280.3，P时间主效应=0.000；F分组主效应=61.89，P分组主效应=0.000；F交互效应=23.27，P交互效应=0.000。

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2.3 HE染色法观察大鼠角膜细胞形态 正常组角膜上皮细胞发育良好，无明显炎症细胞浸润。模型组大鼠的角膜上皮细胞增殖，基底层细胞的排列不整齐，表面有凹凸不平的感觉，而蒙医针刺疗法组则表现为上皮细胞的增殖和基底层的排列紊乱；但与模型组相比，增殖程度仍存在一定的差别，蒙医针刺疗法组明显好于模型组，而玻璃酸钠滴眼液组则可见上皮细胞的增殖，胞索间的排列紊乱。（见图3）

图3 各组大鼠角膜HE 染色照片 （×40）

2.4 RT-PCR法检测各组大鼠角膜组织中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达水平 针刺干预后2周，与模型组比较，蒙医针刺疗法组大鼠角膜组织中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达明显降低（P＜0.05）；与蒙医针刺疗法组比较，玻璃酸钠滴眼液组大鼠角膜组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的表达明显增加（P＜0.05）。针刺干预后4周，与模型组比较，蒙医针刺疗法组大鼠角膜组织中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达明显降低（P＜0.01）；与蒙医针刺疗法组比较，玻璃酸钠滴眼液组大鼠角膜组织中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达明显增加（P＜0.01）；与正常组比较，蒙医针刺疗法组大鼠IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达无明显改变（P＞0.05）。蒙医针刺疗法组4周与蒙医针刺疗法组2周比较，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达明显减少（P＜0.01）；玻璃酸钠滴眼液组4周与玻璃酸钠滴眼液组2周比较，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达无明显改变（P＞0.05）。（见表4）

表4 干预后各组IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNT-α mRNA 比较 （）

表4 干预后各组IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNT-α mRNA 比较 （）

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3 讨论

干眼症是一种由各种原因导致的泪液质或数量的异常，或者由于动态变化而导致的泪膜稳定性降低，同时还伴有眼部不适，以及/或眼表组织的损伤[9-10]。据流行病学调查，约75%的40岁及以上的成人患有干眼症，其中女性更容易患干眼症[11-12]。目前，临床上治疗干眼症一般采用人工泪液，玻璃酸钠滴眼液作为一种优质的人工泪液，具有加快角膜细胞修复、改善眼角膜保湿能力的作用[13-14]，能有效改善患者症状，但患者易出现依赖现象，综合临床效果有待提升。

阿托品是一种常见的副交感神经受体阻断剂，可使泪腺乙酰胆碱含量减少，导致泪液分泌明显下降，继发角膜细胞出现鳞状上皮细胞化生及炎细胞浸润的情况。研究[15]表明，采用阿托品滴眼液局部滴眼3 d能够诱导出比较稳定的干眼症模型，用药后1周左右干眼体征最为明显。与单纯的泪腺切除术比较，阿托品干眼模型具有可逆、合理、简单、快速、经济的特点。本实验采用阿托品诱导的大鼠模型进行泪液分泌和泪膜破裂时间的测定，结果表明阿托品能有效地诱发干眼症。应用蒙医针刺对阿托品诱发的干眼症大鼠进行干预后，角膜细胞活动旺盛，上皮细胞扩张饱满，BUT明显降低，泪液分泌增加。研究表明针刺可通过促进角膜代谢及调节神经反射敏感性以增加泪液分泌，说明蒙医针刺对阿托品引起的干眼大鼠具有良好的疗效。

由于干眼症的发病率逐年升高，并且趋于年轻化，有关干眼症的研究成果也颇为丰富。研究表明，干眼症的发病机制包括激素分泌水平降低、维生素缺乏[16]、自身免疫疾病、神经体液调节异常、细胞过度自噬、细胞凋亡[17]和炎症反应等，其中炎症反应是主导环节和起始因素[18-20]。炎症反应以中性粒细胞浸润为主，伴有多种炎症介质和细胞因子参与。淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等细胞在体内炎症反应高时，会分泌大量的细胞因子IL-2、CRP、TNF-α等，而TNF-α是引起肿瘤细胞在炎症过程中死亡的重要因素[21]。同时，IL-2和CRP能促进炎症细胞的聚集、活化、炎症介质的释放，从而导致局部的炎症反应。LIN X T等[22]通过对大鼠进行IFN-γ和TNF-α的实验，发现了一定程度的炎症反应对免疫功能有影响，说明血清相关因子能促进炎症反应，从而降低机体的免疫功能。实验结果显示，在大鼠模型中，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA均有较高的表达，说明在干眼症的发病过程中，存在与炎症有关的基因表达。经过蒙医针刺治疗后，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的含量明显下降，表明蒙医针刺疗法对阿托品诱导的干眼大鼠有抑制炎症发生的作用。

蒙医认为眼与全身其他脏器之间的联系，要依靠白脉为之连接贯通。眼不断得到白脉输送的气、血的濡养，才能维持正常的功能。针刺调节三根，阵痛，疏通白脉，调整脏腑功能，可以达到抗干眼效果。综上，本研究结果显示蒙医针刺疗法的调节三根，疏通白脉的作用可通过调控炎症因子的表达而实现。但现阶段也存在一定的局限性，蒙医针刺疗法如何从更深层次的分子机制调控干眼症的发生还需要进一步研究。