姜黄素通过β-Catenin/BCL9信号通路介导的细胞自噬调节肝癌细胞的恶性生物学行为*

鲁 猛，王 刚，贾洪艳，李 洋，张 磊，张秋学，李学峰，王 娜

（1．沧州市中心医院，河北 沧州 061000；2．河北医科大学，河北 石家庄 050011）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤，在世界范围内致死率排第二位。我国肝癌发病率与死亡率较高。目前HCC的治疗主要以手术为主，辅以放化疗的方式，但肝癌恶性程度高，术后复发与转移率高，患者预后较差，亟需寻找新的治疗药物与治疗靶点[1-2]。细胞自噬与肝癌发生、转移、靶向治疗和耐药密切相关，调节自噬是治疗HCC与减少耐药的新策略[3]。姜黄素（curcumin，Cur）是植物姜黄的提取物，具有抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞周期阻滞与细胞凋亡、抗肿瘤的作用[4]。Wnt/β-连环蛋白（β-Catenin）信号通路与肿瘤恶性进展和耐药性有关，B细胞淋巴瘤因子9（B-cell lymphoma factor 9，BCL9）是β-Catenin的共激活因子。BCL9能促进β-Catenin通路激活，促进乳腺癌生长、侵袭和转移[5]。研究显示，姜黄素能通过激活自噬，下调磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）/Wnt/β-Catenin信号通路抑制HCC肿瘤生长[6]。故本研究以β-Catenin/BCL9通路为切入点，从细胞自噬角度，探讨姜黄素治疗肝癌的机制。

1 材料

1.1 细胞 肝癌细胞HepG2（批号：TCHu 72）购自上海中科院细胞库。

1.2 主要试剂与仪器 姜黄素（批号：C1386）购自sigma公司；自噬抑制剂3-MA（批号：S276713，纯度：99.97%）购自Selleck；Lipo6000TM转染试剂（批号：C0526）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（批号：C1062S）购自碧云天生物科技有限公司；质粒对照（VEC）（批号：2201051）、Bcl9过表达质粒（OE-Bcl9）（批号：2201052）、shRNA慢病毒载体阴性对照（Sh-NC）（批号：2201061）及shRNA Bcl9慢病毒载体（Sh-Bcl9）（批号：2201062）均购自云舟生物科技股份有限公司；双标腺病毒mRFP-GFP-LC3（批号：HB5421）购自汉恒生物科技（上海）有限公司；微管相关蛋白1轻链3B抗体（LC3B）（批号：ab221794）、自噬关键分子酵母Atg6同系物抗体（Beclin1）（批号：ab207612）、波形蛋白抗体（Vimentin）（批号：ab137321）、E-钙黏蛋白抗体（E-cadherin）（批号：ab40772）、β-Catenin抗体（批号：ab224803）、BCL9抗体（批号：ab113110）均购自Abcam公司。

流式细胞仪（型号：CytoFLEX）购自贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；光学显微镜（型号：WYS-100C）购自天津微仪光学仪器有限公司；透射电子显微镜（型号：Titan KriosG2）购自苏州佐藤精密仪器有限公司；组织包埋机（型号：HistoStar）购自江苏维林科生物技术有限公司；超薄切片机（型号：UM10）购自江苏雷博科学仪器有限公司；激光共聚焦显微镜（型号：LSM 980 with Airyscan）购自武汉世百瑞科技有限公司；自动凝胶成像分析仪（型号：Tanon 3500）购自苏州阿尔法生物实验器材有限公司。

2 方法

2.1 细胞处理及分组 HepG2细胞生长至对数期时，将HepG2细胞分为对照组（Control组）、Cur组、Cur+自噬抑制剂组（Cur+3-MA组）、Cur+质粒对照组（Cur+VEC组）、Cur+Bcl9过表达组（Cur+OE-BCL9组）、Cur+shRNA慢病毒载体阴性对照组（Cur+Sh-NC组）、Cur+shRNA Bcl9慢病毒载体组（Cur+Sh-BCL9组），除Control组外，其余各组均使用20.0 μmol/L[7]的Cur 预处理24 h，Cur+3-MA 组使用20.0 μmol/L 的Cur 与5.0 mmol/L[8]的3-MA共同处理24 h，Cur+VEC组、Cur+OE-BCL9组、Cur+Sh-NC组、Cur+Sh-BCL9组使用20.0 μmol/L的Cur预处理24 h后再进行质粒转染。

2.2 细胞凋亡检测 HepG2细胞（1×105个/mL）接种至6孔板中，按“2.1”的分组进行处理，培养24 h后，调整细胞浓度为4×105个/mL，流式管分别加入20 μL Annexin V-FITC，再加入100 μL细胞悬液，室温避光孵育10 min，加入20 μL PI，室温避光10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.3 细胞迁移与侵袭检测 （1）迁移实验：Transwell小室置于24孔板孔内，下室加入500 μL完全细胞培养液，各组细胞使用无血清培养基制成2×106个/mL的细胞悬液，上室加入200μL细胞悬液，培养48 h，PBS洗涤，95%乙醇固定，结晶紫染色，晾干后树脂封片，镜检，每孔随机选取5个视野计算细胞数量。（2）侵袭实验：Transwell小室上室使用Matrigel基质胶包被，其余步骤同迁移实验。

2.4 自噬体观察 各组细胞使用胰酶消化后，1 200 r/min离心10 min（离心半径：13.5 cm）收集细胞，依次用2.5%戊二醛和1%四氧化锇固定1 h，乙醇脱水后用丙酮置换2次，然后包埋在Epon树脂中，切成50 nm切片，3%醋酸铀酰和柠檬酸铅双重染色15 min，透射电子显微镜观察自噬体。

2.5 自噬体水平检测 将各组HepG2细胞接种到35 mm激光共聚焦培养皿中，细胞生长至对数期时，采用1/2体积感染法将双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染细胞，感染复数（MOI）值为200，感染36 h后，观察荧光表达状况，并拍照记录保存。

2.6 自噬（LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1）、上皮间质转化（Vimentin、Ecadherin）、β-Catenin/BCL9通路（BCL9、β-Catenin）相关蛋白相对表达量 采用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，BCA法蛋白定量后，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜（80 V，90 min），在5%脱脂奶粉中室温封闭1 h。将膜与LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Vimentin、E-cadherin、β-Catenin、BCL9、β-actin一抗（均按照1∶1 000稀释）在4 ℃孵育过夜，用0.1%Tween 20-Tris-缓冲盐水（TBST）洗涤3次，每次10 min；加入二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h。再次用TBST洗涤3次，每次10 min，化学发光法进行显影，然后用自动凝胶成像分析仪拍照并分析。目的蛋白表达水平以目的条带灰度值与内参（β-actin）条带灰度值的比值表示。

2.7 统计学方法 采用SPSS 25.0统计分析，符合正态分布且方差齐的计量资料以（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组HepG2细胞凋亡率比较 Cur组细胞凋亡率明显高于Control组（P＜0.05）；Cur+3-MA组细胞凋亡率明显低于Cur组（P＜0.05），Cur+OE-BCL9组细胞凋亡率明显低于Cur+VEC组（P＜0.05）；Cur+Sh-BCL9组细胞凋亡率明显高于Cur+Sh-NC组（P＜0.05）。（见图1～2）

图1 Cur 对HepG2 细胞凋亡的影响

图1 各组HepG2 细胞凋亡率比较 （，n=6）

3.2 各组HepG2迁移与侵袭细胞数比较 Cur组细胞迁移与侵袭细胞数明显低于Control组（P＜0.05）；Cur+3-MA组细胞迁移与侵袭细胞数明显高于Cur组（P＜0.05）；Cur+OE-BCL9组细胞迁移与侵袭细胞数明显高于Cur+VEC组（P＜0.05）；Cur+Sh-BCL9组细胞迁移与侵袭细胞数明显低于Cur+Sh-NC组（P＜0.05）。（见图3～4）

图3 Cur 对HepG2 迁移与侵袭的影响 （×200）

图4 各组HepG2 迁移与侵袭细胞数比较 （，n=6）

3.3 各组细胞自噬体形成比较 透射电子显微镜观察结果显示，Control组线粒体结构正常，无自噬体与自噬溶酶体形成；Cur组、Cur+VEC组、Cur+Sh-NC组细胞线粒体肿胀，出现大量自噬体；Cur+3-MA组自噬体少于Cur组；Cur+OE-BCL9组自噬体少于Cur+VEC组；Cur+Sh-BCL9组自噬体多于Cur+Sh-NC组。（见图5）

图5 透射电子显微镜观察各组HepG2细胞的自噬体（×20000）

3.4 各组细胞自噬水平比较 GFP-LC3双荧光质粒转染细胞后，激光共聚焦显微镜观察显示，Control组有少量绿色斑点（自噬小体）与红色斑点（自噬溶酶体）；Cur组、Cur+VEC组、Cur+Sh-NC组显示大量绿色与红色，表明有大量自噬小体与自噬溶酶体形成；Cur+3-MA组绿色斑点与红色斑点少于Cur组，自噬小体减少；Cur+OE-BCL9组细胞绿色与红色斑点减少，自噬小体少于Cur+VEC组；Cur+Sh-BCL9组细胞绿色与红色斑点增多，自噬小体多于Cur+Sh-NC组。（见图6）

图6 激光共聚焦显微镜观察各组细胞自噬水平（63×油浸物镜）

3.5 各组细胞自噬及上皮间质转化（EMT）相关蛋白相对表达量比较 Cur组LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相对表达量明显高于Control组（P＜0.05），Vimentin蛋白相对表达量低于Control组（P＜0.05）；Cur+3-MA组LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相对表达量明显低于Cur组（P＜0.05），Vimentin蛋白相对表达量明显高于Cur组（P＜0.05）；Cur+OE-BCL9组LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相对表达量明显低于Cur+VEC组（P＜0.05），Vimentin蛋白相对表达量明显高于Cur+VEC组（P＜0.05）；Cur+Sh-BCL9组LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相对表达量明显高于Cur+Sh-NC组（P＜0.05），Vimentin蛋白相对表达量明显低于Cur+Sh-NC组（P＜0.05）。（见图7～8）

图7 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Vimentin、E-cadherin 蛋白表达Western blotting 图

图8 各组细胞自噬及EMT 相关蛋白相对表达量比较（，n=6）

3.6 各组细胞BCL9、β-Catenin蛋白相对表达量比较 Cur组BCL9、β-Catenin蛋白相对表达量明显低于Control组（P＜0.05）；Cur+3-MA组BCL9、β-Catenin蛋白相对表达量高于Cur组（P＜0.05）；Cur+OE-BCL9组β-Catenin、BCL9蛋白相对表达量明显高于Cur+VEC组（P＜0.05）；Cur+Sh-BCL9组BCL9、β-Catenin蛋白相对表达量明显低于Cur+Sh-NC组（P＜0.05）。（见图9～10）

图9 各组HepG2 细胞BCL9、β-Catenin 蛋白表达Western blotting 图

图10 各组HepG2 细胞BCL9、β-Catenin 蛋白相对表达量比较 （，n=6）

4 讨论

细胞自噬是维持细胞稳态的重要机制，自噬与肿瘤发生发展和耐药密切相关。自噬对肝癌的进展具有促进与抑制的双重作用，临床可根据自噬的作用制定靶向治疗HCC的策略[9-10]。姜黄素是姜黄的主要成分，对鼻咽癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤均有抑制作用。姜黄素的抗肿瘤机制与抑制血管生成、调节细胞自噬、调节基因表达（如p53、Cyclin D等）相关[11-12]。研究[13]显示，姜黄素与5-氟尿嘧啶联用可促进肝癌细胞自噬，抑制细胞增殖。本研究显示，20 μmol/L的姜黄素处理HepG2细胞后，自噬小体形成与细胞凋亡率升高，且姜黄素与自噬抑制剂联合使用，可明显降低HepG2细胞自噬小体形成与细胞凋亡，提示姜黄素可诱导细胞自噬小体形成与凋亡。

LC3Ⅱ与Beclin1是自噬相关标志物，LC3主要介导自噬体的成熟，其水平的高低与自噬体的数量有关，LC3Ⅱ/Ⅰ比值越高表示自噬活性越强[14-15]。Beclin1蛋白可调控自噬前体的形成，引导自噬相关蛋白的定位。Beclin1与相关蛋白形成复合体后，可促进三磷酸磷脂酰肌醇的产生，促进自噬小体的形成[16]。自噬在肿瘤转移过程中发挥重要作用，EMT是癌症转移与侵袭的重要中间阶段，E-cadherin参与调节细胞间黏附作用，Vimentin可维持细胞的完整性和细胞骨架的稳定性，E-cadherin水平降低、Vimentin水平升高是EMT的标志[17]。研究[18]显示，核心蛋白聚糖通过c-Met/Akt/mTOR轴诱导自噬来抑制胶质瘤的侵袭和EMT表型。本研究结果显示，20 μmol/L的姜黄素处理HepG2细胞后，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、E-cadherin表达水平明显升高，细胞迁移与侵袭数及Vimentin蛋白表达水平明显降低，而自噬抑制剂可逆转这一行为，表明姜黄素能通过诱导细胞自噬与凋亡，抑制肝癌细胞转移、侵袭与EMT。

β-Catenin是Wnt通路中Wnt靶基因表达最重要的效应因子。Wnt/β-Catenin信号通路参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移和侵袭，与肿瘤的发生、发展及化疗耐药性密切相关[19]。β-Catenin的激活可促进肝细胞癌的免疫逃逸及增强化疗药物耐药性，从而导致治疗失败[20-21]。BCL9属于Bcl家族成员，β-Catenin需要募集BCL9以介导转录，BCL9可通过β-Catenin途径促进肿瘤细胞的EMT与侵袭[22]。研究[23]显示，BCL9在HCC中表达水平升高，而敲除BCL9基因后，细胞凋亡率明显升高。β-Catenin/BCL9通路在肿瘤的生长与转移过程中发挥重要调控作用[5]。有研究[24]显示，BCL9还与肿瘤细胞自噬有关，下调BCL-9的表达可诱导胶质瘤细胞的凋亡和自噬。本研究显示，姜黄素可明显下调HepG2细胞β-Catenin、BCL9表达水平，提示姜黄素可抑制β-Catenin/BCL9通路激活。过表达BCL9后，HepG2细胞自噬体及迁移与侵袭能力增强，凋亡减少，可减弱姜黄素对HepG2恶性进展的抑制作用，且抑制BCL9表达可促进姜黄素对HepG2恶性进展的抑制作用，表明姜黄素可能通过抑制β-Catenin/BCL9通路，诱导细胞自噬，抑制肝癌细胞迁移、侵袭与EMT。

综上所述，姜黄素能通过抑制β-Catenin/BCL9信号通路，诱导细胞自噬，抑制HepG2细胞恶性生物学行为。