基于Akt/mTOR信号通路探究芍药甘草汤和生麦芽对高泌乳素血症的作用机制*

时萌萌，周 坤，顾洪伟，刘春芳，马 良

（1.武汉市精神卫生中心，湖北 武汉 430022；2.武汉市心理医院，湖北 武汉 430022）

高泌乳素血症（hyperprolactin，HPRL）为临床内分泌科常见疾病，其病因广泛，HPRL可由生理因素、病理因素和药物治疗因素等导致[1-2]。该病可导致患者性功能障碍、骨密度降低、月经紊乱、乳房异常发育、溢乳、下丘脑-垂体-性腺轴抑制，严重时可增加乳腺癌的患病风险[3]。目前，临床上针对HPRL多采用多巴胺受体激动剂-溴隐亭、卡麦角林治疗。但由于治疗过程中极易产生耐药性和严重不良反应，并且溴隐亭和卡麦角林激活多巴胺受体会导致使用多巴胺受体拮抗剂的精神障碍患者治疗失败，故采用上述两药治疗HPRL的远期风险可能大于收益[4-5]。中医药在缓解HPRL方面具有优势[6-7]，当前中药方剂芍药甘草汤[8-11]和生麦芽[12-15]治疗HPRL已有成熟的报道。其疗效温和持久、不良反应少，但其作用机制尚不明确。

高泌乳素血症是泌乳素瘤的典型临床表现。溴隐亭、卡麦角林可能通过自噬和凋亡途径诱导泌乳素瘤细胞死亡[16-17]，进而抑制泌乳素分泌。Akt/mTOR通路是调节自噬的经典信号通路之一[18]，芍药甘草汤和生麦芽是否也是通过调控自噬通路减轻药理性高泌乳素血症有待研究。因此，本研究采用随机对照实验方法研究芍药甘草汤和生麦芽对HPRL大鼠血清泌乳素水平的影响，并结合蛋白免疫印迹法（Western blotting）、免疫组化法（immunohistochemistry，IHC）考察大鼠乳腺组织中p-Akt、p-mTOR、LC3等分子水平，探究两者治疗HPRL作用机制，为寻找更加安全、有效的中药复方提供基础数据，为后期深入的机制研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 奥林巴斯生物显微镜（上海通灏光电科技有限公司，型号：BX53）；酶标仪（美国Molecular Devices公司，型号：FlexStation 3）；微型高速离心机（美国Labnet公司，型号：C2500-R-230V）；电泳仪（上海天能科技有限公司，型号：EPS-600）。

1.2 药物与试剂 生麦芽（批号：2005209）、白芍（批号：2121070104）、炙甘草（批号：1907105）均购自湖北辰美中药有限公司，经武汉市精神卫生中心药学部副主任中药师刘春芳鉴定白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、炙甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根茎加工品、生麦芽为禾本科植物大麦（Hordeum vulgare L.）的成熟果实经发芽干燥的炮制加工品，质量均符合2020年版《中华人民共和国药典》相关项下的规定。盐酸甲氧氯普胺注射液（河南润弘制药股份有限公司，批号：1903072）；甲磺酸溴隐亭片（匈牙利吉瑞大药厂，批号：T06042B）；泌乳素（PRL）ELISA试剂盒（批号：E-EL-R3006）、促黄体生成素（LH）ELISA试剂盒（批号：E-EL-R0026c）、雌二醇（ES）ELISA试剂盒（批号：E-EL-0152c）、孕酮（Pg）ELISA试剂盒（批号：E-EL-0154c）、促卵泡素（FSH）ELISA试剂盒（批号：E-EL-R0391c）均购自伊莱瑞特生物科技股份有限公司；GAPDH兔多抗（杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R 001）；mTOR兔单抗（批号：BM4182）、Akt1兔多抗（批号：A00024）、HRP标记羊抗兔二抗（批号：BA1054）、mTOR（批号：BM4182）均购自武汉博士德生物工程有限公司；p-mTOR兔单抗（批号：5536）、p-Akt兔单抗（批号：4060）、LC3兔单抗（批号：3868）、Phospho-mTOR（Ser2448）（批号：5536）、Phospho-Akt（Ser473）（批号：4060）、LC3（批号：3868）均购自Cell Signaling Technology。其余所用试剂均为分析纯。

芍药甘草汤制备：参照文献[9]，取芍药、甘草（质量比为3∶1）适量，药材加水至没过药物表面3～5 cm，浸泡30 min，武火煮沸，然后用文火煎煮30 min，取煎液。继续加水至没过药渣表面约3 cm，按上述方法重复煎煮1次，混合两次煎液，过滤，将煎煮液浓缩至质量浓度为2.0 g/mL的流浸膏，置于4 ℃冰箱保存备用，临用时稀释。

生麦芽煎煮液制备：取生麦芽药材适量，加水至超过药物表面3～5 cm，浸泡30 min，武火煮沸，然后用文火煎煮30 min，取煎液。继续加水至超过药渣表面约3 cm，按上述方法重复煎煮1次，混合两次煎液，过滤，将煎煮液浓缩至质量浓度为2.5 g/mL的流浸膏，放置于4 ℃冰箱保存备用，临用时稀释。

1.3 实验动物 SPF级雌性（未孕）SD大鼠40只，体质量（203.2±3.7）g，购自三峡大学实验动物中心，动物合格证号：42010200 004627，实验动物许可证号：SCXK（鄂）2017-0012。所有大鼠饲养在华中科技大学实验动物中心SPF级动物房，饲养环境温度控制在20～26 ℃，相对湿度保持在40%～70%，昼夜各半循环照明，饲养期间大鼠自由饮水饮食。实验过程中所有操作均符合科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。

2 方法

2.1 模型建立、分组及给药 随机取8只大鼠作为正常组，其余大鼠为造模组。造模组大鼠背部皮下注射盐酸甲氧氯普胺注射液（50 mg/kg），2次/d，连续注射7 d[19]。7 d后取血清检测泌乳素（PRL），造模组大鼠PRL明显高于正常组（P＜0.05），说明造模成功。采用随机数字表法将造模成功的32只大鼠分为模型组、芍药甘草汤组、生麦芽组和溴隐亭组，每组8只。大鼠给药剂量以实验动物与人的体表面积比换算，人和大鼠按体表面积折算的等效剂量比值为0.018，计算大鼠剂量（mg/kg）=系数（6.3）×人的剂量（mg/kg）。芍药甘草汤组给药剂量为12.6 g/（kg·d），生麦芽组给药剂量为31.5 g/（kg·d），溴隐组给药剂量为0.53 mg/（kg·d），正常组和模型组给予等体积蒸馏水，各组均采用灌胃给药，1次/d，连续给药30 d。

2.2 观察指标

2.2.1 样本采集与样品制备 于末次给药结束12 h后，以10%水合氯醛腹腔注射行大鼠麻醉术，麻醉剂量按照0.3 mL/100 g计，麻醉后腹主动脉采血，所取血液用高速离心机离心（3 000 r/min，10 min，离心半径为8.55 cm）取上层血清；同时剥离每组大鼠的乳腺，分离其第2、3对乳腺组织，备用。

2.2.2 检查方法与检测指标

2.2.2.1 酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清激素水平 将得血液样本经高速离心（3000r/min，10min，离心半径为8.55cm）取上层血清，采用酶联免疫分析法测定泌乳素（PRL）、促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（Pg）、促卵泡素（FSH）水平，实验操作流程严格按照ELISA试剂盒说明书步骤进行，于450 nm波长下用酶标仪读取光密度（OD值），通过标准曲线计算各样品中上述指标的含量。

2.2.2.2 蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测大鼠乳腺组织中自噬相关因子表达 取乳腺组织块于4 ℃预冷的匀浆缓冲液中匀浆，高速离心（12000r/min，5min，离心半径为8.55 cm），取上清液作为样品，BCA法测定其蛋白质浓度。配制10%分离胶和5%浓缩胶，加样后电泳转模，室温封闭2 h，加入相应一抗GAPDH（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶2 000）、mTOR（1∶500）、p-mTOR（1∶1 000）。4 ℃孵育过夜，洗膜；加入HRP标记羊抗兔二抗（1∶50 000）37 ℃孵育2 h，ECL发光液孵育后经凝胶成像系统曝光成像，使用Gel-Proanalyzer 4图像分析软件读取灰度值并统计分析，检测各组大鼠乳腺组织Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表达水平。

2.2.2.3 免疫组化检测大鼠乳腺组织中自噬相关因子表达分别取各组大鼠乳腺组织包埋、切片、脱蜡，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，加一抗mTOR（1∶100）、PhosphomTOR（Ser2448）（1∶100）、Akt（1∶200）、Phospho-Akt（Ser473）（1∶200）、LC3（1∶100）；加酶标二抗HRP标记羊抗兔二抗（1∶100），加显色剂，复染、脱水、封片，将晾干的切片在显微镜下观察并采集图像。

2.2.2.4 乳腺组织病理特征 分别取各组大鼠乳腺组织，用甲醛固定，石蜡包埋切片，经苏木精-伊红（HE）染色，于高倍显微镜下观察各组大鼠乳腺组织病理形态变化。

2.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料以（）表示。若计量资料满足正态分布和方差齐性，则多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；不满足方差齐性的情况下采用Games-Howell法比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠血清激素水平比较 模型组大鼠血清PRL水平高于正常组（P＜0.01），FSH、LH、Pg、E2水平低于正常组（P＜0.01），表明造模成功。溴隐亭组大鼠血清PRL水平低于模型组（P＜0.01），LH、FSH、Pg和E2水平高于模型组（P＜0.05或P＜0.01）；芍药甘草汤组、生麦芽组大鼠血清PRL水平低于模型组（P＜0.01），芍药甘草汤组大鼠血清FSH、Pg水平高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），生麦芽组大鼠血清FSH、Pg和E2水平高于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。（见表1）

表1 各组大鼠血清激素水平比较 （）

表1 各组大鼠血清激素水平比较 （）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＞0.05，cP＜0.01，dP＜0.05。

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3.2 各组大鼠乳腺组织病理形态学比较 正常组大鼠乳腺组织未呈现增生状，乳腺小叶数量少、体积小、分布均匀，乳腺腺泡和导管无增生，腔内无分泌物。与正常组比较，模型组大鼠乳腺小叶数量明显增多、体积增大，小叶腺泡数量增多，腺泡和导管明显扩张，腔内有大量分泌物；与模型组比较，芍药甘草汤组和生麦芽组大鼠乳腺增生情况均改善，乳腺小叶、腺泡和导管增生减少，腔内无分泌物或仅有少量分泌物出现。（见图1）

图1 各组大鼠乳腺组织切片图 （HE，×400）

3.3 Western blotting检测各组大鼠乳腺组织中自噬相关因子表达情况 模型组大鼠乳腺组织中LC3-Ⅱ/Ⅰ高于正常组（P＜0.01），说明模型组大鼠乳腺组织中自噬水平较高；芍药甘草汤组、生麦芽组和溴隐亭组大鼠乳腺组织中及LC3-Ⅱ/Ⅰ均低于模型组（P＜0.01），表明芍药甘草汤、生麦芽和溴隐亭可以抑制甲氧氯普胺注射造成的自噬水平提升。模型组大鼠乳腺组织p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量高于正常组（P＜0.01），芍药甘草汤组、生麦芽组和溴隐亭组大鼠乳腺组织p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均低于模型组（P＜0.01），表明芍药甘草汤、生麦芽和溴隐亭可抑制p-Akt和p-mTOR蛋白表达。（见图2、表2）

图2 各组大鼠乳腺组织中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达Western blotting 图

表2 各组大鼠乳腺组织中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 相对表达量及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值比较 （）

表2 各组大鼠乳腺组织中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 相对表达量及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值比较 （）

注：与正常组比较，aP＞0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＞0.05，dP＜0.01。

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3.4 IHC检测各组大鼠乳腺组织中自噬相关因子表达情况 模型组大鼠乳腺组织中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表达水平高于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），结果与Western blotting检测结果相互佐证。芍药甘草汤组、生麦芽组、溴隐亭组大鼠乳腺组织中p-Akt、p-mTOR、LC3蛋白表达水平低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；芍药甘草汤组、溴隐亭组大鼠乳腺组织中mTOR蛋白表达水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（见图3、表3）

图3 各组大鼠乳腺组织Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表达 （免疫组化，×400）

表3 各组大鼠乳腺组织Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表达水平比较 （）

表3 各组大鼠乳腺组织Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表达水平比较 （）

注：与正常组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＞0.05，dP＜0.05，eP＜0.01。

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4 讨论

高泌乳素血症在中医学上属于“闭经”“月经失调”“乳泣”等范畴[20]。女性月经、胎孕、乳汁均与脏腑气血化生密切相关。肾藏精，肝藏血，肝肾同源。肾精亏则肝木无所涵养、气血不足，血无法下行胞宫为月经，反上逆为乳汁，因而表现为溢乳、闭经等[21]。肾虚精亏、肝失疏泄而致气血失和、瘀血内阻，可见肝、脾、肾三脏功能失调为高泌乳素血症主要病因，气滞、肝郁、痰浊、瘀血为主要病机。高泌乳素血症主要辨证为肝郁气滞证、肝郁肾虚证、痰湿阻滞证、脾虚血瘀证4个证型[22]。芍药甘草汤对肝郁气滞证、肝郁肾虚证、痰湿阻滞证和脾虚血瘀证均有较好的调理作用。方中白芍苦、酸、微寒，归肝、脾经，可治疗肝血亏虚、月经不调、肝脾不和和胸胁脘腹疼等。其作用特点在于能补能泻，专行血海，女人调经胎产，一切肝病，皆宜用之。甘草甘平，归心、肺、脾、胃经，可治疗脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、痈肿疮毒等。其作用在于补脾益气、祛痰止咳、调和诸药，脾、胃、肺、心四脏同调。白芍、甘草相合，共奏酸甘化阴、滋阴柔肝、调合营卫、调气疏郁之功，对气滞、肝郁、痰浊、瘀血等为主要病机的高泌乳素血症有较好地缓解作用。因而芍药甘草汤在高泌乳素血症相关症状的缓解和治疗上具有其独到之处。基于此本研究考察芍药甘草汤对高泌乳素血症相关症状的缓解和治疗作用，并结合相关技术手段探究其作用机制。

芍药甘草汤（质量比为3∶1）和生麦芽均可降低泌乳素水平，但生麦芽在降低HPRL的同时，能够同时升高FSH、Pg、E2水平，且升高三者的幅度较芍药甘草汤更明显，尤其是升高E2水平几乎与溴隐亭疗效相当。这在临床上具有重要意义，从而印证了生麦芽在治疗乳汁异常分泌、不孕症、高泌乳素血症方面有其独特优势。

研究发现，PRL对乳腺组织有直接刺激作用，可抑制Pg、FSH、LH的分泌，从而加速乳腺组织的过度增殖；此外，PRL还可与雌激素和Pg一起促进乳腺上皮细胞生长，导致乳腺增生[23]。本研究结果表明，芍药甘草汤和生麦芽均可改善大鼠乳腺增生，在改善增生形态、减少增生数量、抑制分泌物形成等方面都表现出一定优势。同时，蛋白免疫印迹实验及免疫组化实验结果显示，芍药甘草汤组和生麦芽组大鼠乳腺组织中p-AKT、p-mTOR、LC3-Ⅱ/Ⅰ水平显著低于模型组，进一步印证了芍药甘草汤与生麦芽可能通过调控乳腺组织自噬相关蛋白水平而治疗高泌乳素血症。

孟延兵[11]研究认为升高FSH、抑制垂体PRL mRNA、泌乳素调节元结合蛋白（PREB）mRNA表达是芍药甘草汤治疗高泌乳素血症作用机制。龚晓云[13]研究发现麦芽治疗高泌乳素血症作用机制包括3个方面：（1）通过依赖于多巴胺D2受体的单靶点途径发挥抗高泌乳素血症作用；（2）直接作用于PKA，通过抑制PKA活性降低PRL水平；（3）上调DRD2与DAT受体水平启动cAMP/PKA/CREB信号通路。曹钰羚等[24]研究表明麦芽治疗高泌乳素血症作用机制与多巴胺介导的泌乳素通路调控相关。郭润竹[25]研究认为麦芽治疗高泌乳素血症作用机制与抑制TLR4/NF-κB/MAPK12信号通路的活化有关。朱梦军等[26]研究表明麦芽治疗高泌乳素血症作用机制是通过降低高泌乳素血症大鼠脑垂体PRL的表达而达到治疗作用。前期研究[27]表明，芍药甘草汤可能通过调控FoxO、HIF-1、PRL、Jak-STAT、PI3K-Akt和MAPK等信号通路发挥治疗HPRL的作用。本研究证实芍药甘草汤和生麦芽均能通过降低大鼠乳腺组织中p-Akt、p-mTOR、LC3蛋白表达水平而发挥治疗作用。

综上所述，芍药甘草汤、生麦芽可通过多靶点、多通路的相互作用治疗高泌乳素血症。研究结果体现了中医药治疗多部位、多靶点和整体调节的治疗特色。

芍药甘草汤、生麦芽在治疗剂量下降低高泌乳素血症大鼠血清PRL水平的效果相当，且能够不同程度抑制乳腺组织p-Akt、p-mTOR及LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平，其作用机制可能与减轻乳腺组织中自噬作用相关。本研究结果可为芍药甘草汤和生麦芽治疗高泌乳素血症提供实验依据。