蒙药额尔敦-乌日勒非靶向代谢组学研究*

高 娃，包斯琴，王青亮，都格尔，锡林其其格，乌汉其木格,

（1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古自治区中蒙医药研究院，内蒙古 呼和浩特 010017；3.内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010065）

蒙药额尔敦-乌日勒，又名“桑培奴布日布”[1]、钦达穆尼组方[2]、珍宝丸[3]等，由制珍珠、沉香、诃子、红花等29味蒙药材组成[4]。其可改善血液浓度，疏通经络，修复陈旧组织的神经血管损伤[5]，具有清热安神、舒筋活络、去黄水、化痰活血、醒脑开窍、消瘀止痛、扶正固本之功效[6-7]。额尔敦-乌日勒是蒙医治疗白脉病、脑出血、脑血栓、神经损伤、神经根炎等疾病的首选药物[8-9]，在临床上应用广泛。如额尔敦-乌日勒与奥拉西坦联合治疗血管性痴呆效果显著[10]；额尔敦-乌日勒结合西医治疗老年2型糖尿病合并高血压有明显疗效[11-12]；额尔敦-乌日勒在脑出血治疗中有显著的增益作用[13-15]，可促进微血管增生，保护和改善受损神经功能，改善脑缺血及脑梗死[16-18]；额尔敦-乌日勒还可有效预防和治疗神经源炎性痛敏性偏头痛[19]，但有关其活性成分和作用机理研究相当缺乏。已报道的神经保护活性成分有红花、肉豆蔻、甘草、草果、川楝子、栀子、土木香、木香、荜茇和黑种草所含16种小分子化合物[20]，但其作用机理尚不明确。揭示其药效作用机理，明确其入血成分是首要条件。

本研究采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）鉴定额尔敦-乌日勒大鼠灌胃给药后的入血成分，并分析差异代谢物及相关通路，旨在为明确额尔敦-乌日勒的活性成分及作用机理提供依据。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠6只，雌雄各半，体质量180～220 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。大鼠购回后，第一时间按雌雄分开饲养于内蒙古国际蒙医医院标准动物实验房。饲养条件：室温（23±3）℃，相对湿度为40%～60%，明暗周期12 h，大鼠自由摄取动物饲料和饮用纯净水，隔1 d换清洁级垫料。本研究所有程序都是在实验动物的指导原则下进行的，并得到内蒙古国际蒙医医院伦理委员会的批准（批准号：2022-004）。

1.2 药物与试剂 额尔敦-乌日勒（批号：20190828，规格：60丸/盒）由内蒙古国际蒙医医院国家蒙药制剂中心提供；LC-MS级甲醇（批号：A456-4）、LC-MS级甲酸（批号：A117-50）、色谱级醋酸铵（批号：A114-50）均购于美国Thermo Fisher公司；LC-MS级水（批号：1.15333.2500）购于美国Merck公司。

1.3 主要仪器 Q ExactiveTMHF质谱仪（德国赛默飞世尔公司）；Vanquish UHPLC色谱仪（德国赛默飞世尔公司）；Hypesil Gold column色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）（德国赛默飞世尔公司）；D3024R低温离心机（美国赛洛捷克公司）。

2 方法

2.1 分组和给药 将6只SD大鼠随机分为空白组（KB）和给药组（ED），每组3只。将大鼠适应性饲养14 d后禁食、不禁水12 h，给药组大鼠按0.54 g/kg剂量灌胃给予额尔敦-乌日勒，空白组大鼠灌胃生理盐水，灌胃体积均为1 mL/100 g。给药90 min后腹主动脉采血，血液收集在普通采血管中，于室温静置1 h进行凝固分层，于室温下1 610×g离心10 min，取上清液分装到1.5 mL离心管中，用于后续实验。

2.2 样本处理 取100 μL血清样本置于离心管中，加入400 μL质谱级甲醇，涡旋震荡，冰浴静置5 min，于4 ℃条件下15 000×g，离心10 min，取一定量的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53%，并置于离心管中再次于4 ℃条件下，以15 000×g，离心10 min，收集上清液，进行LC-MS分析。

2.3 仪器参数

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Hyperil Gold column（C18）（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱温为40 ℃；流速为0.2 mL/min；进样量为10 μL；正模式：流动相A为0.1%甲酸，流动相B为甲醇；负模式：流动相A为5 mmol/L醋酸铵，流动相B为甲醇[21]。色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 色谱梯度洗脱程序

2.3.2 质谱条件 扫描范围选择（m/z）100～1 500；ESI源的设置如下：喷雾电压为3 200 V；鞘气流速为40 arb；辅助气流速为10 arb；离子传输管温度为320 ℃。极性为正极、负极；MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描。

2.4 数据处理 将LC-MS原始数据导入Compound Discoverer3.1（CD3.1,Thermo Fisher）搜库软件中，进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后对不同样品根据保留时间偏差0.2 min和质量偏差5 ppm进行峰对齐，使鉴定更准确，随后根据设置的质量偏差为5 ppm、信号强度偏差为30%、信噪比为3、最小信号强度为100 000、加合离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud、mzVault和Masslist数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到数据的鉴定和定量结果。通过人类代谢组数据库（human metabolome database，HMDB）和脂质代谢途径研究计划（Lipid metabolites and pathways strategy，LIPID MAPS）数据库对定量结果进行分类注释分析。差异代谢产物筛选基于给药组与空白组比较，以P＜0.05，且log2FC＞0（log2FC＞0为上调、log2FC＜0为下调）为筛选条件纳入差异有统计学意义的代谢产物。相关差异代谢通路图通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）进行搜索和分析。代谢途径分析使用MetaboAnalyst 5.0。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料服从正态分布，采用配对样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 实验数据质量控制 为了对实验数据进行质量控制，取所有大鼠个体的血清样品少量，等体积混合均匀后制得质控（quality control，QC）样本，用于平衡LC-MS系统和监测仪器状态。通过QC样品的重现性和稳定性评估仪器状态，方法及数据的可靠性。结果正、负离子模式下的R2均大于0.98接近于1，说明数据具有良好的可靠性。（见图1）

图1 QC 样本相关性分析

3.2 小分子化合物的非靶向分析 对空白组与给药组血液成分分别在Compound Discoverer 3.1进行分子式预测并对mzCloud、mzVault和Masslist数据库同时进行搜库，鉴定到777个小分子化合物。在正离子模式下，给药组与空白组大鼠血清中共检测到491小分子化合物；在负离子模式下，给药组与空白组血清中共检测到286个小分子化合物。将上述777个小分子化合物在HMDB数据库中进行搜索，共发现297个小分子化合物，其中正离子模式下178个、负离子模式下119个。可见正负离子模式下，脂类及非脂类化合物最多。（见图2）

图2 HMDB 分类注释统计图

基于LIPID MAPS数据库共鉴定出186个小分子化合物，其中正离子模式下鉴定出78个小分子化合物，负离子模式下鉴定出108个小分子化合物。在HMDB和LIPID MAPS两个数据库中同时鉴定到的有73个小分子化合物，其中正离子模式下有37个，负离子模式下有36个，可见甘油磷酰胆碱化合物最多。（见图3）

图3 LIPID MAPS 分类注释统计图

3.3 差异代谢产物的分析 相对含量分析结果显示，给药组与空白组大鼠血清有67个代谢物具有明显差异，即给药组有55个代谢物上调，12个代谢物下调。（见表2）由图4可知，上述67个差异代谢物中大部分化合物的相对含量升高，少数化合物的相对含量降低，差异明显。（见图4）

图4 给药组与空白组大鼠差异代谢物热图

表2 给药组与空白组大鼠血清差异代谢物（排名前10）

3.4 差异代谢物通路分析 对额尔敦-乌日勒给药组和空白组筛选的67个差异代谢物进行进一步的KEGG通路富集分析，发现这些差异代谢物共参与11条通路，分别是核黄素代谢（Riboflavin metabolism）、甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism）、甾类激素生物合成代谢（Steroid hormone biosynthesis）、淀粉和蔗糖代谢（Starch and sucrose metabolism）、视黄醇的代谢（Retinol metabolism）、柠檬酸循环代谢（Citrate cycle，TCA cycle）、药物代谢-细胞色素P450（Drug metabolismcytochrome P450）、乙醛酸和二羧酸代谢（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢（Glycine, serine and threonine metabolism）、不饱和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）、酪氨酸代谢（Tyrosine metabolism），其中富集最多的是核黄素代谢、甘油磷脂代谢、甾类激素生物合成代谢、柠檬酸循环代谢、乙醛酸和二羧酸代谢。（见图5）

图5 给药组与空白组大鼠差异代谢物KEGG 通路富集图

3.5 额尔敦-乌日勒入血成分的分析 通过对空白组与给药组血液成分进行单独搜库分析对比，结果显示给药组血清中鉴定出入血成分共237个小分子化合物，正离子模式下152个，负离子模式下85个。其中，51个是额尔敦-乌日勒原型成分（展示20个成分），如肉豆蔻酸、牛黄熊去氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、雄酮、没食子酸酯、甘草次酸等，其余186个是额尔敦-乌日勒复方中沉香、牛黄、麝香、丁香、甘草等单药所含成分产生的代谢产物。（见图6、表3）

图6 给药组大鼠血清中检测到的小分子化合物分类

表3 额尔敦-乌日勒入血原型成分

4 讨论

蒙药额尔敦-乌日勒是预防和治疗心血管及神经系统疾病的常用药物，并具有神经保护作用，疗效显著。目前，关于额尔敦-乌日勒的有效成分、作用机制及入血成分仍不明确。本研究基于LC-MS非靶向代谢组学方法分析了额尔敦-乌日勒入血成分及潜在作用机制，发现额尔敦-乌日勒给药后可对多个代谢通路进行干预和调整，如核黄素、胆碱、乙酰胆碱、睾酮等对机体有益的差异代谢物含量升高，给药后的差异代谢物主要富集于核黄素代谢、甘油磷脂代谢、甾类激素生物合成代谢、柠檬酸循环代谢和乙醛酸和二羧酸代谢等代谢通路。

核黄素又称维生素B2，是体内黄酶类辅基的重要组成部分[22]。核黄素因其抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌等特性而被广泛研究[23]。有研究表明，核黄素可以预防偏头痛，减轻局灶性脑缺血损伤的神经保护作用，具有良好的神经保护作用[24-26]。此外，核黄素与其他化合物或药物的组合可以具有多种作用和保护特性，并在治疗中可以减少药物的毒性作用[23]。本研究结果表明额尔敦-乌日勒对体内核黄素代谢具有一定的调节作用。而这一作用可能与其神经保护作用密切相关。

其次是甘油磷脂代谢，该代谢的紊乱可引起炎症反应，导致神经元不可逆的损伤。胆碱和乙酰胆碱是甘油磷脂代谢的2个内源性化合物。人的脑组织有大量乙酰胆碱，这是一种重要的中枢胆碱神经递质，能维持胆碱能系统正常运行和长期记忆的生理基础，起着神经调节剂的作用[27]。但乙酰胆碱的含量会随着人年龄的增长而下降。胆碱是合成乙酰胆碱的前体之一。有研究报道，提高神经突触间隙的神经递质乙酰胆碱水平，能够增强神经突触传递效果，改善阿尔茨海默病患者的认知障碍[28-29]。

此外，甾体激素，雄激素和雌激素对认知功能具有重要的影响，可促进学习记忆等认知功能，并降低淀粉样蛋白在人脑的聚集，可调节海马未成熟神经元的数量及海马棘突触密度，对脑功能具有保护作用[29-30]。柠檬酸循环是糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质代谢和能量代谢的枢纽，乙醛酸和二羧酸代谢可看作柠檬酸循环的支路和中间产物的补给途径[31-32]。这些途径直接或间接参与体内氧化还原反应和能量代谢等调节。可见额尔敦-乌日勒可对多个代谢通路同时参与和调节，在多个靶点发挥药效。本研究结果表明，额尔敦-乌日勒可能通过调节内源性代谢物的平衡，发挥调节体内氧化还原平衡及能量代谢的作用。

5 结论

本研究采用LC-MS非靶向代谢组学方法在额尔敦-乌日勒给药血清中共鉴定出777个小分子化合物，67个差异代谢物。差异代谢物主要富集在核黄素代谢、柠檬酸循环代谢、甘油磷脂代谢等11个相关代谢通路。同时，额尔敦-乌日勒的入血成分有237个，其中代谢产物有186个、入血原型成分有51个。结果可为蒙药额尔敦-乌日勒的质量控制、潜在活性成分的筛选及作用机理的研究提供重要依据。