基于生物信息学筛选研究衰老小鼠免疫B细胞的基因差异

刘逸南 刘奕清 杨静 修成奎 王雪 胡艳红 吴丹 吴烨 雷燕

(中国中医科学院医学实验中心 北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室,北京 100700)

根据全球人口预测分析,预计到2025年,全球60岁以上人口将达到12亿左右,到2050年老年人口将增至20亿〔1,2〕。而80岁或80岁以上的人口估计从目前的1.37亿到2050年将增加到4.25亿。老龄人口的迅速增长提高了心脑血管疾病、高血压及阿尔茨海默病等疾病及其并发症的发病率,给全球的医疗资源带来巨大负担〔3～5〕。因此,探索衰老的机制对于延缓人口老龄化有重要意义。2013年,López-Otín等〔6〕提出了9个代表衰老共同特征的初步特征:①基因组不稳定;②端粒消耗;③表观遗传改变;④蛋白质停滞状态的丧失;⑤营养感知失调;⑥线粒体功能障碍;⑦细胞衰老;⑧干细胞衰竭;⑨细胞通讯改变。这些年龄依赖性的变化会影响人体维持稳态的能力,其中就包括免疫系统。研究表明,老年人的免疫系统与年轻人相比有所不同,由于骨髓造血干细胞数量和功能的下降,影响了T细胞与B细胞的生长,其数量会随着年龄的增长而显著减少〔7～9〕。免疫系统的改变使老年人更容易感染传染病,而且还会导致许多退行性疾病,特别是神经退行性病变、癌症、心血管和自身免疫性疾病〔10〕。尽管近几年对于免疫系统的衰老已经取得了一定的成果,但是对于探索其发生机制还需要对分子调控机制进行深入研究。本研究旨在通过生物信息学分析研究衰老小鼠与青年小鼠B细胞的基因差异,以期为衰老机制研究及临床开发抗衰老药物提供依据和新思路。

1 材料和方法

1.1数据来源 通过NCBI提供的GEO数据库检索并下载数据集GSE72224,该试验来自Illumina MouseWG-6 v2.0 expression beadchip GPL6887平台。

1.2研究方法 通过NCBI的GEOR2平台对GSE72224进行初步分析,并将结果下载整理成Excel格式,并进行差异基因分析。使用Origin2019b软件(9.6.5.169)对数据进行可视化分析。使用WebGestalt(WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit,http://www.webgestalt.org/)对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。同时使用R语言3.5.3对结果进行可视化展现。使用STRING(https://string-db.org)在线分析工具构建差异表达基因的蛋白质互作网络。之后使用Cytoscape3.6.1(http://cytoscape.org/download_old_versions.html)软件将蛋白质互相网络进行可视化分析,采用cytoHubba及MOCDE插件筛选出关键基因及关键模块。并将关键模块的基因进行GO功能富集和KEGG通路分析。

2 结 果

2.1差异基因的筛选 通过来源于GEOR2平台的6～8周龄青年小鼠(n=11)及超过17月龄的老年小鼠(n=6)共计17个样本的B细胞进行分析,共获得26 509个差异基因,对总体差异基因的数据进行火山图绘制,见图1。按照P<0.01,|log2差异倍数(FC)|>1条件进行筛选,可获得87个差异基因。其中包括66个下调基因及21个上调基因。通过对样本数据Z-score方法进行归一化,将差异最显著的前30个基因进行聚类热图分析,见图2。两组样本中部分基因的表达有明显差异。

图1 差异表达基因的火山图

图2 青年小鼠和老年小鼠B细胞中前30个差异表达基因的聚类热图

2.2差异表达基因的GO功能富集和KEGG通路分析 在WebGestalt数据库输入差异基因,从生物过程、细胞成分和分子功能3个方面对差异基因进行GO富集分析。基于BH算法,错误发现率(FDR)<0.05对87个差异表达基因进行分析发现,只有生物过程和细胞成分两个方面的分析具有统计学差异。其中,生物过程主要富集于B细胞、淋巴细胞及白细胞的活化、调节和增殖、肽基氨基酸修饰与核小体组装等方面,见图3。分子成分主要富集于内质网、内质网腔、细胞表面、染色质、核染色质、核小体、DNA包装复杂及染色体部分等方面,见图4。将上述 87个基因进行KEGG信号通路分析,以BH法对结果进行统计学分析,发现只有内质网的蛋白质加工通路具有统计学显著性。有内质网凝集素(Erlec)1、内质网核心信号(Ern)1、热休克蛋白(Hsp)1a、内质网α-甘露糖苷酶(Man1b)1、蛋白二硫化物异构酶(Pdi)A4、Lin-12抑制子/增强子(Sel1l)此6个通路相关基因。

图3 GO功能富集分析的气泡图:生物过程

图4 GO功能富集分析的气泡:细胞成分

2.3构建蛋白质相互作用(PPI)网络筛选关键基因 使用STRING在线分析工具构建差异表达基因的PPI,下载表格数据,使用Cytoscape软件将PPI网络进行可视化分析,见图5。根据各点的连接值,采用cytoHubba插件,按照node degree>5筛选出H2A组蛋白家族成员(H2af)x,Zeste基因增强子人类同源物(Ezh)2,Pdia4,H2B组蛋白家族成员b(Hist2h2bb),白细胞介素(IL)-10,Sel1l,Dnajb9,泛素样含PHD和环指域(Uhrf)1此8个关键基因。

图5 差异表达基因的PPI

2.4差异表达基因的模块分析 使用Cytoscape中的MCODE插件对PPI进行模块分析,最终获得图6两组模块,并将关键模块的基因进行富集分析。GO功能富集分析结果如表1所示,对模块1的分析发现,仅有细胞成分的差异具有统计学差异。模块2在生物进程、细胞成分及分子功能方面均有明显差异。KEGG分析发现,仅有模块2在内质网蛋白加工通路具有统计学差异,FDR<0.05。

表1 模块1与模块2的GO富集功能分析

图6 模块1(左)与模块2(右)的PPI

3 讨 论

衰老与免疫功能的普遍降低有关,如何在自然衰老过程中保持免疫系统功能的完整性是目前国内外学者关注的问题〔11,12〕。

本研究发现,获取的差异基因与B细胞活化、内质网及内质网蛋白加工通路等有关。B细胞活化是通过B细胞受体识别抗原,导致B细胞增殖和分化,而活化的B细胞可以分化形成能够产生抗体和IL-10、IL-17、IL-35和肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子的血浆细胞或提供长期预防继发性感染的记忆细胞〔13～15〕。Strindhall等〔16〕提出循环B细胞的减少是机体衰老的一个典型特征。Bulati等〔17〕研究发现随着B细胞的增殖减少,其分化为浆细胞和记忆细胞的能力减弱,使得人体的免疫功能减弱。不仅如此,B细胞与内质网也密切相关。Yang等〔18〕研究发现,内质网内的E3泛素连接酶对于B细胞的分化有调控作用。细胞内蛋白质质量控制组分丢失而引起机体蛋白质稳定网络的崩溃也是衰老的特征之一〔19,20〕。内质网是真核细胞的膜性管状网络,在钙稳态、脂质和蛋白质生物合成中发挥重要作用〔21〕。内质网内蛋白质量控制失调导致的蛋白聚集是细胞衰老的表现之一〔22,23〕。Matai等〔24〕通过研究饮食控制对秀丽隐杆线虫寿命的影响,进一步证实了内质网激素能够调控蛋白停滞,进而延长寿命。本文结果表明,细胞成分差异及内质网的蛋白质调控与衰老有巨大关联,值得深入研究。

H2afx(或H2AX)是H2A组蛋白家族的成员之一,是检测和反映DNA双链断裂的基础〔25〕,也是基因不稳定的公认标记〔26〕。Wang等〔27〕通过对小鼠的肺、脾、皮肤、肝和肠道上皮等组织及细胞的H2afx表达进行免疫组化,发现其标记强度与年龄增加有关。Ezh2是多梳抑制复合物2的一个成员,已被证明可以调节DNA甲基化〔28〕。Mozhui等〔29〕研究发现Ezh2是形成衰老表观基因组的蛋白质机制的一部分。Pdia4是最大的蛋白质二硫异构酶家族成员,具有氧化还原酶和陪同活性,其在体内可启动凝血并促进血栓形成引起一系列级联反应,与慢性阻塞性肺疾病及肾纤维化等多种慢性疾病有关〔30,31〕。除此之外,Linden等〔32〕研究发现位于内质网中的Pdia4负责蛋白质折叠,其表达随着内质网应激反应的增强而增加。Hist2h2bb在食管鳞癌上皮与正常食管相比有表达差异〔33〕。IL-10是白细胞产生的多效调节细胞因子〔34〕。Rousset等〔35〕研究发现,IL-10能够激活B细胞,促进其生存和增殖,促进类切换和抗体分泌。Sel1l是未展开蛋白反应/内质网相关降解途径的一个组成部分〔36〕。Ji等〔37〕研究发现,B细胞前体中Sel1l-Hrd1复合体的缺失会导致大前B细胞向小前B细胞转变过程中严重的发育障碍。Dnajb9是DNAJ蛋白家族的一个成员,是一种内质网常驻蛋白〔38〕。Lee等〔39〕研究发现,Dnajb9能够抑制小鼠原发性成纤维细胞的衰老。Uhrf1是一种多功能的表观遗传调控因子,它将DNA甲基化与组蛋白甲基化、泛素化和乙酰化等多个组蛋白翻译后修饰相结合〔40〕。Chen等〔41〕研究发现,Uhrf1能够调节B细胞的增殖和亲和力成熟,进而控制机体内病毒感染。

综上,生物信息学研究表明老年小鼠及青年小鼠B细胞的差异表达基因主要与B细胞活化及内质网等有关。并且定义了H2afx、Ezh2、Pdia4、Hist2h2bb、IL-10、Sel1l、Dnajb9、Uhrf1此8个为关键基因,主要参与了B细胞发育、DNA甲基化和内质网的蛋白质调控等过程,为进一步探索衰老与免疫系统的影响机制提供了新思路。但是有关基因的上下游作用点,还需深入研究。