生物技术专业分子生物学实验的建立与思考<br/>——以反向点杂交检测β-地中海贫血基因类型为例

生物技术专业分子生物学实验的建立与思考
——以反向点杂交检测β-地中海贫血基因类型为例

2023-10-24王咸寿杜冠魁颜冬菁

科技风 2023年29期

唐敏王咸寿郑琳杜冠魁颜冬菁

海南医学院基础医学与生命科学学院海南海口 571199

作为地方院校,本校生物技术专业定位于应用型人才的培养,分子生物学及诊断技术是其专业课程之一。由于本校地处在热带地区的海南省,β-地中海贫血(β-thalassemia)是本地常见遗传疾病。研究发现海南省育龄人群中β-地中海贫血突变基因携带率与患病率达12.95%,常见的突变类型有CD41-42(-TTCT)、-28(A>G)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD71-72(+A)以及CD17(A>T),以CD41-42(-TTCT)最常见[1]。临床上采用反向点杂交检测常见的β-地中海贫血基因类型,本校在生物技术专业开设反向点杂交检测β-地中海贫血基因类型的实验项目,作为分子生物学诊断技术的实验内容之一。笔者采取分子克隆的方法,将常见的β-珠蛋白基因突变类型克隆至质粒上,建立模板库,丰富实验内容。同时对本实验项目的教学提出思路,采用小教师+翻转课堂教学法,充分激发学生学习兴趣,且思政教育同行,以期对以学生为中心的教学改革起抛砖引玉的作用。

1 β-珠蛋白基因类型模板库的建立

携带β-珠蛋白基因CD41-42(-TTCT)、-28(A>G)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD71-72(+A)与CD17(A>T)杂合子突变的基因组DNA由本实验室保存[2]。分别以这5种杂合子突变的基因组DNA为模板,设计引物扩增β-珠蛋白基因,上游引物序列为CATATTCTGGAGACGCAGGAAGAGA,下游引物序列为CATGGAAGGAACACTTCAGGGGAAA,PCR产物为2432bp。采用LA Taq(宝日医生物技术(北京)有限公司)进行PCR扩增,体系如下:基因组模板1μL,上下游引物各0.2μM,dNTPs 200μM,LA taq 2.5U,1×buffer,补水至25μL;扩增程序如下:95℃ 10min,开启32个循环(95℃ 50s,61℃ 30s,72℃ 2.5min),72℃ 5min。回收PCR目的片段,与pGEM-T easy载体(Promega)进行TA克隆,挑白斑进行菌落PCR鉴定。由于基因组DNA模板都是杂合子,菌落PCR鉴定正确的重组子可能是β-珠蛋白突变类型,也可能是野生型,最终由测序确定其基因型。测序结果表明,在32个循环数的前提下,LA Taq扩增2432bp的片段,有3～5个随机突变。挑取目标突变类型附近无突变的重组质粒作为模板,采用β-地中海贫血基因检测试剂盒[亚能生物技术(深圳)有限公司]检测β-珠蛋白基因突变类型,结果如图1所示,实验结果与理论值相符。其中单一的重组质粒结果如果图1A～图1F所示,检测结果为纯合子突变,结果分别判读为IVS-Ⅱ-654(C>T)纯合子、-28(A>G)纯合子、CD41-42(-TTCT)、野生型、CD71-72(+A)纯合子与CD17(A>T)纯合子;将两种不同突变类型的质粒混合,得到复合突变类型,如图1G所示,结果判读为IVS-Ⅱ-654(C>T)与-28(A>G)复合突变;将突变型质粒与野生型质粒混合作为模板,检测结果为杂合子突变,如图1F与图1G所示,结果分别判读为CD41-42(-TTCT)杂合子与-28(A>G)杂合子。结果表明成功建立该教学实验。

图1 以重组质粒为模板进行反向点杂交检测β-珠蛋白基因型

A-I的结果判读如下:A.IVS-Ⅱ-654(C>T)纯合子;B.-28(A>G)纯合子;C.CD41-42(-TTCT)纯合子;D.野生型;E.CD71-72(+A)纯合子;F.CD17(A>T)纯合子;G.IVS-Ⅱ-654(C>T)与-28(A>G)复合突变;H.CD41-42(-TTCT)杂合子;I.-28(A>G)杂合子;J为膜条上各斑点的基因型,N表示对应位点的正常基因型,M表示对应位点的突变基因型。

2 以学生为中心的教学思考

本实验面向第6学期(大三下学期)的生物技术专业本科生开设,该年级的学生已掌握生物化学的理论知识与实验技术,掌握分子生物学的基本操作,如提取基因组DNA、提取全血或者组织RNA、琼脂糖凝胶电泳、PCR技术等。因此对本实验项目提出如下教学目标:(1)知识目标:理解反向点杂交检测β-地中海贫血基因突变的原理,熟悉PCR与核酸杂交的原理与实验操作,理解β-地中海贫血致病机制;(2)能力目标:提高分析问题、提出问题以及解决问题的能力;(3)情感目标:培养良好的实验习惯,培养严谨的逻辑思维,鼓励科普宣教。针对以上教学目标,坚持以学生为中心的教学方式,摒弃教师满堂灌的方式,笔者提出以下教学思路。

2.1 招募小教师,师生互换角色

小教师模式的教学方法已有报道[3-4],即开课前招募热爱生物学科、愿意参与实验准备和辅助教学的学生,在课前参与实验准备、预实验操作,课中参与实验原理的分享、实验安全管理、主持分组讨论等。笔者曾在本校2020级生物技术学生中发布问卷,结果表明有73%(73/100)的学生愿意来当小教师,说明相对于传统的教学方式,学生更乐意采取主动学习的形式。通过小教师模式的教学,促进师生之间的交流互动,增加学生在实验准备阶段的动手机会,促进学生对整个实验的准备、授课过程的思考,可帮助提高其提出问题、分析问题以及解决问题的能力;同时,小教师在授课过程可选择性地讲解一部分内容,在实验过程充当小助手,而教师对小教师的讲解与操作示范进行补充,师生合作,促进双方在教学过程中更快进入状态,达到双赢的效果。

2.2 充分利用课堂等待时间,翻转课堂

在本实验项目教学过程中,有很多需要等待的时间,例如PCR需要约3小时,杂交需要约1小时等。为在规定课时内完成实验教学,可先加样PCR后,在PCR等待的时间,可以由小教师讲解实验原理,组织实验小组同学分组进行讨论,讨论主题包括但不限于如下:(1)地中海贫血的定义、发病率、危害以及诊断;(2)“反向点杂交”的解读,为什么叫“反向”“点”“杂交”?实验操作说明书的解读,实验结果的判读;(3)实验过程中PCR操作如何避免假阳性?(4)人血红蛋白的基因表达谱,分析β珠蛋白基因结构,分析各常见突变基因型如CD41-42(-TTCT)、-28(A>G)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD71-72(+A)与CD17(A>T)的发生频率以及致病机制;(5)如果反向点杂交结果阴性,是否代表该模板DNA绝对是野生型,没有突变位点?(6)如果将来有一天大家就职于某教学实验室,需要建立反向点杂交检测β-珠蛋白基因突变类型的教学实验,如何建立模板?小教师可以将本实验如何操作的过程分享给大家。(7)检测β-珠蛋白的突变类型,除了临床上常用的反向点杂交方法,还有其他的方法吗?

翻转课堂需要同学们在课前做好预习的功课,目前笔者所在的生物技术专业实验室已经开展实验操作视频的拍摄,在教学过程中可通过学习通平台发布教学视频与教学资料以及在平台上布置实验报告等,有利于教学实施。

2.3 因材施教,延伸课堂内容

有文献报道[5-6]以地中海贫血为例,在临床医学实践教学中采用PBL教学方法,课堂讨论的主题更注重于疾病的病因、诊断、治疗以及遗传咨询等。与培养临床医学专业学生不同,本实验项目的开设对象是生物技术专业的学生,应该更注重于应用能力的培养,例如实验的正确操作、实验原理的理解,并能根据实际的实验室条件解决具体的问题。因此,除了在翻转课堂中讨论的主题之外,还可以适当延伸课堂内容,作为自主学习的内容。例如,地中海贫血与疟疾的关系[7];反向点杂交检测β-地中海贫血基因经典文献的阅读[8];一步法检测β-地中海贫血基因突变——荧光探针PCR法[9],通过阅读该文献,对比两种方法的优缺点,引导同学们思考分子诊断试剂的技术研发,激发同学们开发先进分子诊断试剂的兴趣,提升生物技术专业的自豪感。

2.4 思政教育与教学同行

立德树人是高等教育的根本任务,而思政教育是落实立德树人的途径之一。在实验教学过程中:(1)应加强诚信教育,尊重原始数据与实验结果;(2)培养良好的实验习惯,例如当天的实验记录尽量当天整理好,以免时间长了遗忘;不戴手套随意关门,严格遵守实验区域划片等;(3)注意实验室安全,不在实验室吃饭,及时无害化处理实验材料,例如抽取质粒的菌液应高压灭菌处理;(4)鼓励科普宣教,海南省是地中海贫血高发区,特别是β-地中海贫血,发生纯合子突变时,患儿在出生6个月后才开始表现出症状,为家庭与社会带来很大的负担,因此大学生可在假期做好科普工作,鼓励高发区育龄夫妇做好产前诊断工作;(5)在教学中培养团队合作精神,培养获取知识的能力等。