壮药多裂黄檀不同极性部位的总黄酮含量测定及抗氧化活性研究

王维玉，陈文娇，卢澄生，覃思思，朱 敏，韦建华，陈明伟

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

氧化应激是指体内氧化、抗氧化平衡状态被打破，导致机体内自由基大量积累、炎细胞浸润、蛋白酶分泌及氧化中间产物产生过量，引起细胞损伤及凋亡的一种不良反应，并可进一步诱发机体衰老以及癌症、老年痴呆症、帕金森病、糖尿病等各种疾病的产生［1-2］。抗氧化物质能够清除过量自由基从而发生抗氧化作用，但由于合成抗氧化剂具有一定毒副作用，在食品、医疗保健和化妆品生产使用上有一定的限制，因此，从天然产物中寻找安全、有效、无副作用的天然抗氧化剂成为近年来研究热点［3-5］。黄酮类化合物是一类存在于自然界的具有2-苯基色原酮结构的化合物，研究表明，黄酮类化合物可通过清除自由基、抑制与活性氧（reactive oxygen species，ROS）相关酶的产生以及促进细胞分泌抗氧化剂介质（如谷胱甘肽和维生素E）来减少氧化应激，延缓组织和器官衰老［6］。

多裂黄檀（Dalbergia rimosaRoxb.）来源于豆科黄檀属植物多裂黄檀的干燥根，广西各地均有分布，壮药名为Gengpeng（更彭）、Meikouwai（美扣外），具有调龙路、除湿毒、消肿痛的作用，可用于治疗头痛、痈疮、疔疮等［7-8］。目前，国内外研究发现多裂黄檀与降香黄檀具有相当高的亲缘关系，并且二者挥发性成分相似度极高［9-10］。黄檀属作为一个重要的药用资源，在我国具有悠久的药用历史，化学成分研究表明该属植物含有大量黄酮、二氢黄酮、异黄酮、异黄烷、新黄酮等黄酮类成分［11-12］。本文采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定多裂黄檀不同极性部位总黄酮的含量，采用DPPH、ABTS 自由基清除法和FRAP 法测定其自由基清除能力和总抗氧化能力，对多裂黄檀抗氧化活性部位进行筛选，以期为该植物中抗氧化活性化学成分的开发研究奠定基础。

1 实验材料

1.1 材料与试剂 多裂黄檀药材于2020年11月采自广西南宁市大明山，经广西中医药大学廖月葵高级实验师鉴定为豆科黄檀属植物多裂黄檀Dalbergia rimosaRoxb.的干燥根茎，样品标本（No.20201112）存放于广西中医药大学中药化学实验室。芦丁对照品（纯度≥98%，中国药品生物制品检定所）；L-抗坏血酸（VC，纯度＞99%，上海麦克林生化科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH，纯度＞98%，美国Sigma-Aldrich 公司）；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS，纯度＞99%，美国Sigma-Aldrich 公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ，纯度＞99%，上海麦克林生化科技有限公司）；无水乙酸钠（分析纯，西陇科学股份有限公司）；硝酸铝（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；冰乙酸（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水三氯化铁、七水合物硫酸亚铁（上海麦克林生化科技有限公司）；其他试剂均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器 TECAN Infinite M200 Pro 多功能酶标仪（瑞士TECAN 公司）；UV-1800C 型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；LABCONCO 冷冻干燥机（美国Labconco 公司）；BSA224S-CW 电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；HWS-24电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；RE-2000A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；pHB-1 笔型酸度计（上海世诺物理光学仪器有限公司）。

2 方 法

2.1 样品提取与制备 称取1.0 kg 多裂黄檀粗粉，用10倍量80%乙醇回流提取2 h，过滤，滤渣再分别提取1.5 h、1 h，合并3 次滤液，减压浓缩，得多裂黄檀醇提物浸膏53.2 g。取10.0 g 多裂黄檀醇提物浸膏进行冷冻干燥，得到醇提物干样品。余下的43.2 g 醇提物浸膏加入一定量蒸馏水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取至颜色较浅或近无色，收集萃取液，分别减压浓缩得到石油醚部位浸膏0.8 g、乙酸乙酯部位浸膏3.9 g、正丁醇部位浸膏10.9 g 及水部位浸膏16.7 g，将浸膏进行冷冻干燥，得到各极性部位干样品。

2.2 总黄酮含量测定 采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法［13］测定多裂黄檀不同极性部位的总黄酮含量。精确吸取0.5 mg/ml 的芦丁标准溶液1 ml，置于10 ml容量瓶中，加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，静置6 min；加入10%的硝酸铝溶液0.3 ml，摇匀，静置6 min；加入4%的氢氧化钠溶液4 ml，最后用无水甲醇定容至刻度，摇匀，静置10 min，以无水甲醇为空白对照，在400～800 nm波长范围扫描，确定其最大吸收波长为502 nm。在波长502 nm 处测定芦丁标准品系列溶液吸光度，得到芦丁质量浓度（X）与吸光度值（Y）的回归方程：Y=1.113 7X+0.000 9（R2=0.999 8），表明芦丁质量浓度在0.025～0.5 mg/ml 间线性关系良好。取各样品溶液（质量浓度为1.0 mg/ml）1 ml，以不加样品的相同溶剂为空白对照，相同条件下测定各样品溶液的吸光度，根据回归方程计算各样品中的总黄酮浓度（C1），并根据样品初始浓度（C2）计算出样品中总黄酮的含量。总黄酮含量（%）=（C1/C2）×100%。

2.3 抗氧化活性的测定

2.3.1 清除DPPH自由基能力的测定 参考文献［14］的测定方法稍作调整，分别精密吸取20 μl 多裂黄檀不同极性部位样品溶液，置于96 孔板中，分别加入0.10 mmol/L DPPH 工作液200 μl，混匀，避光反应30 min，在波长517 nm 处测定其吸光度（A1）。以不加样品的相同溶剂为空白对照（A0），抗坏血酸（VC）作为阳性对照，每个浓度平行测定3 次后取平均值，计算样品对DPPH 自由基的清除率。自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100%。

2.3.2 清除ABTS 自由基能力的测定 参考文献［15］的测定方法稍作调整，将2.45 mmol/L 过硫酸钾与7.4 mmol/L ABTS 溶液按体积比1∶1 混合均匀后，室温下避光过夜放置24 h，用无水乙醇稀释至其吸光度在734 nm 下测得为（0.70±0.02），即得到ABTS 工作液。分别精密吸取20 μl 多裂黄檀不同极性部位样品溶液，置于96 孔板中，分别加入ABTS 工作液200 μl，混匀，避光反应30 min，在波长734 nm 处测定其吸光度（A1）。以不加样品的相同溶剂为空白对照（A0），VC作为阳性对照，每个浓度平行测定3次后取平均值，根据公式计算样品对ABTS 自由基的清除率。自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100%。

2.3.3 总抗氧化能力的测定 参考文献［16-17］的测定方法，将0.3 mmol/L 醋酸缓冲溶液（pH3.6）、20 mmol/L FeCl3溶液、10 mmol/L TPTZ溶液按照10∶1∶1配制成FRAP 工作液，现配现用。精密吸取20 μl不同浓度FeSO4标准溶液，置于96 孔板中，加入37 ℃预热的FRAP 工作液200 μl，混匀，37 ℃水浴避光反应10 min，以蒸馏水作空白对照，于593 nm 处测定吸光度，得FeSO4浓度（X）与吸光度值（Y）的标准曲线：Y=1.055 9X-0.001 2（R2=0.999 9），表明FeSO4在质量浓度为0.1～1.6 mmol/L 内线性关系良好。以各样品溶液代替FeSO4溶液，相同条件下测定各样品溶液的吸光度，以VC 作为阳性对照，不加样品的相同溶剂为空白对照，每个浓度平行测定3 次后取平均值。根据各样品反应后的吸光度值在标准曲线上对应FeSO4的浓度与其相应浓度的比值（mmol/g）来表示样品的总抗氧化能力。

2.4 数据处理与分析 采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为有显著性差异。采用Excel 2016、GraphPad Prism 9 以及Origin 2017 软件进行数据处理及绘图、计算半数清除浓度（IC50），并使用Pearson 软件对多裂黄檀不同极性部位总黄酮含量与抗氧化活性进行相关性分析。

3 结 果

3.1 多裂黄檀不同极性部位总黄酮含量比较 见表1。

表1 多裂黄檀不同极性部位总黄酮含量比较

由表1 可知，多裂黄檀各极性部位总黄酮含量为4.28%～36.44%，其中乙酸乙酯部位总黄酮含量最高［（36.44±0.26）%］，不同极性部位总黄酮含量由高到低依次为乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞醇提物＞水部位＞石油醚部位。结果表明，多裂黄檀中黄酮类物质多集中在乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

3.2 抗氧化活性的测定

3.2.1 多裂黄檀不同极性部位对DPPH 和ABTS 自由基的清除能力 见图1、图2、表2。

图1 多裂黄檀不同极性部位不同浓度对DPPH自由基的清除能力

图2 多裂黄檀不同极性部位不同浓度对ABTS自由基的清除能力

表2 多裂黄檀不同极性部位对DPPH和ABTS自由基的半数清除浓度比较（mg/ml，）

表2 多裂黄檀不同极性部位对DPPH和ABTS自由基的半数清除浓度比较（mg/ml，）

样 品醇提物石油醚部位乙酸乙酯部位正丁醇部位水部位VC n3 3 3 3 3 3清除DPPH自由基的IC50 0.492 5±0.009 3 2.848 7±0.140 9 0.377 7±0.007 2 0.431 3±0.124 0 0.732 2±0.009 9 0.078 6±0.000 2清除ABTS自由基的IC50 0.071 7±0.001 0 0.797 7±0.033 2 0.066 9±0.000 7 0.092 5±0.000 9 0.089 1±0.000 5 0.057 9±0.001 0

由图1、图2 和表2 可知，多裂黄檀不同极性部位对DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率随着各样品浓度的增加而增大，具有一定的量效关系。对DPPH自由基的清除作用，以乙酸乙酯部位的清除能力最强，IC50为（0.377 7±0.007 2）mg/ml，余依次为正丁醇部位、醇提物、水部位、石油醚部位，与总黄酮含量趋势变化一致。对ABTS自由基的清除作用，以乙酸乙酯部位的清除能力最强，IC50为（0.066 9±0.000 7）mg/ml，余依次为醇提物、水部位、正丁醇部位、石油醚部位，且乙酸乙酯部位、醇提物、水部位和正丁醇部位的清除能力接近于阳性对照药VC。

3.2.2 总抗氧化能力的测定 见表3。

表3 多裂黄檀不同极性部位的总抗氧化能力 （mmol/g，）

表3 多裂黄檀不同极性部位的总抗氧化能力 （mmol/g，）

样 品醇提物石油醚部位乙酸乙酯部位正丁醇部位水部位VC n3 3 3 3 3 3总抗氧化能力（FPAP）1.042 5±0.018 0 0.241 0±0.002 0 1.594 5±0.012 0 1.254 5±0.004 0 0.889 5±0.001 0 8.010 0±0.170 0

表3 结果显示，多裂黄檀乙酸乙酯部位总抗氧化能力最强，FRAP 值为（1.594 5±0.012 0）mmol/g；各极性部位总抗氧化能力由高到低依次为：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞醇提物＞水部位＞石油醚部位，与总黄酮含量趋势一致。

3.2.3 抗氧化活性与总黄酮含量的相关性分析 见表4。

表4 多裂黄檀不同极性部位总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析

由表4 可知，多裂黄檀不同极性部位总黄酮含量与DPPH、ABTS 自由基清除能力呈现负相关性，即总黄酮含量越高，其对应IC50越低，抗氧化效果越好，相关系数均＞0.72，但均无显著性差异（P＞0.05）。不同极性部位部位总黄酮含量与总抗氧化能力（FRAP 值）相关系数为0.944 0，并且存在显著性差异（P＜0.05）。

4 讨 论

大量研究表明，黄酮类化合物具有较好的抗氧化作用，近年来，寻找安全又天然的生物抗氧化剂是研究热点，总黄酮是公认的与抗氧化活性密切相关的天然化学成分［18］。本实验研究结果显示，多裂黄檀中黄酮类物质多集中于乙酸乙酯部位和正丁醇部位，使用不同极性溶剂可以实现对多裂黄檀黄酮类成分的有效富集。同时，采用DPPH 法、ABTS 法、FRAP 法对多裂黄檀不同极性部位的体外抗氧化能力进行评价，其中乙酸乙酯部位、正丁醇部位表现出较好的抗氧化能力。相关性分析显示，多裂黄檀不同极性部位的总抗氧化能力和黄酮含量存在正相关性，相关系数为0.9440，黄酮含量越高，抗氧化能力也越强，由此推测黄酮类物质可能是多裂黄檀抗氧化的主要成分之一，乙酸乙酯部位和正丁醇部位为多裂黄檀的主要活性部位。此外，多裂黄檀不同极性部位在三个抗氧化性试验结果并不完全一致，原因可能与抗氧化反应的检测方法、作用机制不同有关［19］。

目前，国内外关于多裂黄檀化学成分及药理作用的研究较少，本实验表明乙酸乙酯部位和正丁醇部位为多裂黄檀抗氧化的主要活性部位，可为多裂黄檀进一步筛选具体的活性单体成分，明确抗氧化活性成分提供参考。