miR-619-5p对乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响

刘施妍,廖德宇,胡 凯,余伙梅,余 涛, 陈远香,张 彦

(重庆医科大学检验医学院,临床检验诊断学教育部重点实验室, 重庆 400016)

尽管目前的诊疗手段已极大地改善了部分乳腺癌患者的预后,但其发病率和癌症死亡病例数仍占据女性恶性肿瘤的第一位[1],乳腺癌的远处转移与复发仍旧给临床治疗带来挑战[2]。微小RNA(microRNA,miRNA或miR)属于小分子非编码RNA的范畴,其结构通常包括19～25个核苷酸。靶基因mRNA的3′-非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)可与之特异性地结合并受其调节,是miRNA发挥作用的经典途径[3-4]。miRNA可以调节乳腺癌的生长转移[5-6]和免疫逃逸[7]等生物学过程。miR-619-5p是近年来新发现的miRNA,在人类各种恶性肿瘤组织中均有异常表达[8-10]。例如,miR-619-5p在结直肠癌[11]、口腔鳞状细胞癌[9]中低表达,而在非小细胞肺癌中高度表达[12]。本课题组早期研究显示,miR-619-5p可能对乳腺癌有重要影响,然而,它的具体功能和机制仍不明确。本课题拟就miR-619-5p在乳腺癌细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程以及增殖与转移等生物学行为中的作用进行初步研究,基于一系列生物信息学分析对其靶基因进行探索,以期为乳腺癌诊断及治疗提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料永生化的正常乳腺上皮MCF-10A细胞、人类乳腺癌MDA-MB-231细胞系和MCF-7细胞保存于重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室;miR-619-5p模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)及其阴性对照均由上海生工生物工程公司设计合成;TranswellTM小室(Corning公司);DMEM高葡萄糖培养基(HyClone company);胎牛血清(Clark公司);上海陶术(Topscience)生化科技有限公司提供Cell Counting Kit-8(CCK-8)溶液;RNA快速提取试剂盒(奕杉生物科技有限公司);GP-transfect-Mate转染试剂(GenePharma公司);逆转录试剂盒(TaKaRa公司);qRT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;2×SYBR Green qPCR Master Mix购自Biomake公司;上海碧云天(Beyotime)生物技术公司提供RIPA裂解液及Western blot所用试剂;ECL显影液(BioSharp公司);小鼠抗人类β-肌动蛋白(β-actin)抗体(南京钟鼎生物有限公司);兔抗人上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)抗体、兔抗人神经钙黏蛋白(neural cadherin, N-cadherin)抗体、兔抗人波形蛋白(Vimentin)抗体、兔抗人锌指结构转录因子(Snail)抗体均来自proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息学分析 利用dbDEMC数据库(https://www.biosino.org/dbDEMC/index)miRNA-seq数据,对miR-619-5p在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的表达差异进行分析;miR-619-5p的靶基因通过检索miRTarBase(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)和miRDB(https://mirdb.org/)数据库取交集预测得到;富集通路分析通过KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)数据库进行;利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)和HPA(https://www.proteinatlas.org/)数据库分析CREB1在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的表达差异;Kaplan-Meier Plotter工具(http://kmplot.com/analysis/index.phpp=background)用于评估CREB1对患者无复发生存率的影响。

1.2.2细胞培养与转染 MDA-MB-231与MCF-7细胞(贴壁生长)采用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清和100 kU·L-1链霉素-青霉素),并将其置于37 ℃培养箱中恒温培养,CO2浓度为5%。用直径6 cm培养皿接种3×105个细胞,在60%～80%细胞汇合度时,按照GP-transfect-Mate转染试剂说明,将inhibitor-NC、inhibitor、mimic-NC和mimic分别转染细胞,4～6 h更换培养基,24～48 h后作后续处理。

1.2.3qRT-PCR对乳腺癌细胞和MCF-10A细胞中miR-619-5p水平和乳腺癌细胞的EMT相关分子的 mRNA水平检测 转染细胞24 h后提取细胞总RNA,用1 μg总RNA进行逆转录(逆转录程序:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s;4 ℃,∞);通过qRT-PCR技术将上述逆转录得到的cDNA模板,进行扩增以检测目的基因。采用U6或GAPDH为内参基因,分别检测各组miR-619-5p的表达水平和N-cadherin、 E-cadherin、 Vimentin、 Snail mRNA水平。miR-619-5p的茎环引物5′-GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCT CA-3′用于逆转录。

Tab 1 Primer sequence of quantitative real-time PCR primer sequence

1.2.4Western blot实验测定细胞中目的蛋白的表达 使用RIPA裂解液将转染48 h后的细胞完全裂解以获得的细胞总蛋白质,并立即通过分光光度法检测蛋白的含量,然后每组蛋白样本中添加1/4体积的上样缓冲液(5×),100 ℃沸水煮沸加热10 min以使其变性。将每孔上样量为25～30 μg的蛋白样本使用8%或10% SDS-PAGE凝胶进行电泳,采取湿转法转膜至PVDF膜,然后用5%脱脂奶粉进行封闭,37 ℃,2～3 h。PVDF膜与鼠抗人β-actin(内参照)单抗(1 ∶1 000)、兔抗人E-cadherin多抗(1 ∶5 000);兔抗人N-cadherin多抗(1 ∶2 000);兔抗人Vimentin多抗(1 ∶2 000);兔抗人Snail多抗(1 ∶1 000);兔抗人CREB1多抗(1 ∶1 000)等一抗,于4 ℃孵育12～16 h。用TBST清洗3 次PVDF膜,每次10 min;加入山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG二抗(辣根过氧化物酶标记,1 ∶5 000稀释),37 ℃下孵育1 h;再次清洗膜,用ECL显影液完全覆盖膜条,Image Lab自动凝胶成像系统曝光显影并分析目的蛋白的灰度值。相对蛋白表达水平通过将每个目的蛋白的灰度值归一化表示(以β-actin蛋白的灰度值为内参照)。

1.2.5CCK-8法检测miR-619-5p在细胞增殖中的作用 96孔板中接种100 μL含转染24 h后的细胞3×103个的细胞悬液,培养6～8 h后,在每组5 个复孔中加入10 μL CCK-8试剂,全程避光并混匀(计为0 h),置于培养箱2 h后,各孔的吸光度(OD值)由酶标仪测定,波长参数为450 nm,在培养24、48、72 h后重复添加CCK-8试剂并测量的步骤,最后绘制出生长曲线。

1.2.6划痕愈合实验评估miR-619-5p对细胞横向迁移的作用 在6孔培养板中培养转染后的乳腺癌细胞,每孔细胞数目3×105个。在细胞融合度在90%左右时,用10 μL小枪头在培养板中间,匀速笔直划线制造划痕,随即用PBS清洗1遍,加入双无DMEM高糖培养基并拍照(记为0 h)。培养24 h和48 h后,选择同一位置拍照,划痕距离由ImageJ软件检测分析。平均划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h(或48 h)划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.7TranswellTM实验检验miR-619-5p对细胞迁移和侵袭所起作用 迁移实验不需提前添加基质胶,侵袭实验需提前稀释基质胶(基质胶原液 ∶无胎牛血清培养基=1 ∶9)并取40 μL铺在小室的上层,于37 ℃培养箱中将小室静置1 h。转染24 h后,细胞被消化并重悬于双无DMEM高糖培养基中,镜下计数并调整密度,随后沿上室壁加入400 μL细胞密度为3×107个·L-1的细胞悬液,700 μL DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)添加至下室,在37 ℃下继续培养,24 h后用PBS缓冲液将小室轻轻漂洗2次,在室温下用多聚甲醛(4%)固定15 min,随后再用结晶紫染液(0.1%)避光染色15 min,PBS漂洗过程中将上室未通过室膜的细胞用湿棉签擦除,等待小室晾干后,每个组别随机选择3 个视野在尼康Ti-S倒置显微镜下观察,用NIS-Elements成像软件对其进行拍照并计数。

1.2.8统计学方法 独立重复3次以上实验,所有实验结果采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析,使用t检验进行各组内两两比较,使用单因素方差分析比较两组及以上组间数据。

2 结果

2.1 miR-619-5p在乳腺癌中低表达通过分析dbDEMC数据库miRNA-seq数据显示,乳腺癌组织中miR-619-5p的表达比正常乳腺组织更低。乳腺癌细胞MDA-MB-231与MCF-7中miR-619-5p的表达量较正常乳腺细胞MCF-10A更低也经qRT-PCR实验验证。见Fig 1。

2.2 miR-619-5p抑制乳腺癌细胞的增殖相较于对照组,乳腺癌细胞中miR-619-5p表达在转染miR-619-5p mimic后明显升高,转染miR-619-5p inhibitor后,细胞中miR-619-5p的表达相应减少。CCK-8实验结果提示,通过高表达miR-619-5p明显削弱了乳腺癌细胞的增殖活性,而抑制miR-619-5p的表达后,细胞的增殖能力得到促进。见Fig 2。

Fig 1 Expression of miR-619-5p in breast cancer and

Fig 2 Proliferation of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

2.3 miR-619-5p对乳腺癌细胞的侵袭和迁移起抑制作用通过划痕愈合实验发现,miR-619-5p低表达的乳腺癌细胞在24、48 h的划痕愈合率均高于对照组,而过表达miR-619-5p使乳腺癌细胞24、48 h划痕愈合率明显低于对照组。通过TranswellTM迁移与侵袭实验发现,低表达miR-619-5p的实验组通过小室膜的细胞数目明显高于对照组,而miR-619-5p过表达的实验组通过小室膜的细胞数目明显减少。见Fig 3。

Fig 3 Migration and invasion of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

2.4 miR-619-5p抑制乳腺癌细胞的EMTqRT-PCR和Western blot结果显示,在两种细胞系中,过表达miR-619-5p使得促EMT分子Snail或间充质标志物N-cadherin和Vimentin的表达下降,但上皮标志物E-cadherin的表达上调;而在低表达miR-619-5p的乳腺癌细胞中则得到相反的结果。以上结果提示,miR-619-5p可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231与MCF-7的EMT过程。见Fig 4。

2.5 miR-619-5p靶基因预测通过miRTarBase和miRDB数据库对miR-619-5p的靶基因进行了联合交集预测,共筛选到95个miR-619-5p潜在靶基因,对以上候选基因进行GO和KEGG的富集分析利用KOBAS数据库实现。分析结果显示,miR-619-5p的靶基因在cAMP信号通路(hsa04024)、代谢通路(hsa01100)、cGMP-PKG信号通路(hsa04022)、TGF-β信号通路(hsa04350)、Toll样受体信号通路(hsa04620)、TNF信号通路(hsa04668)等途径中起重要作用。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1(CREB1)得分较高,且与EMT相关的miR-619-5p靶基因之一,通过miRDB数据库对其与miR-619-5p的结合位点进行了预测。在MDA-MB-231细胞中分别过表达或抑制miR-619-5p后,CREB1的mRNA与蛋白表达随之下调或上调,而抑制miR-619-5p的表达则导致CREB1的蛋白水平上升。GEPIA数据库mRNA-seq数据显示,CREB1在乳腺癌组织中的表达高于正常组织;HPA数据库的免疫组化结果进一步表明,CREB1在正常乳腺组织中主要高表达于腺细胞和肌上皮细胞,另外,脂肪细胞的表达量则处于中等水平;而在乳腺癌组织中,CREB1集中在乳腺癌细胞核高表达。此外,通过Kaplan-Meier Plotter分析显示,CREB1高表达的患者具有更低的无复发生存率(RFS)。见Fig 5。

Fig 4 EMT of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

Fig 5 Prediction for target genes of miR-619-5p and pathway enrichment and impact of miR-619-5p on CREB1

3 讨论

乳腺癌具有全球女性恶性肿瘤中位列第一的高发病率和死亡率[1]。尽管乳腺癌患者的5年生存率已提升了近15%[13],但对于乳腺癌晚期和特定亚型,如三阴性乳腺癌,其治疗方案十分有限,易发生治疗耐药、转移复发等。因此,探究乳腺癌发生发展的分子机制,寻找治疗分子靶点仍至关重要。

miRNA的异常表达几乎贯穿了乳腺癌的整个发生发展过程,对乳腺癌的增殖、转移、代谢、免疫逃逸以及调控肿瘤微环境等多方面等产生影响。目前,miR-619-5p作为一种新发现的miRNA,在肿瘤中主要通过与LncRNA, circRNA构成竞争性RNA网络(ceRNETs)发挥作用。例如,miR-619-5p在结肠腺癌组织中低表达,且在机制上LncRNA ILF3-AS1可与miR-619-5p结合并降低其表达,从而调节下游靶基因CAMK1D促进结肠腺癌的进展[14]。另有研究表明LncRNA PVT1可通过吸附miR-619-5p调节Pygo2和ATG14的表达水平,进而影响Wnt/β-catenin信号转导途径和自噬活性,促进胰腺癌对吉西他滨耐药[10]。在血清外泌体和尿外泌体中的miR-619-5p也可作为新型肿瘤标志物[8-15]。本研究选用三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和ER阳性的MCF-7细胞株进行实验,通过分别转染miR-619-5p的模拟物以及抑制剂来进行正反验证。多项体外功能试验显示,乳腺癌细胞的增殖活性,迁移与侵袭能力,在一定程度上均被miR-619-5p抑制。这与在胰腺癌[10],口腔鳞状细胞癌[9]等所报道的miR-619-5p发挥抑制癌细胞增殖与转移的作用类似,而与在神经胶质瘤细胞中miR-619-5p发挥促癌作用则截然不同。

肿瘤细胞在EMT发生时逐渐由上皮样(Ep样)转变为间质样(M样),这使其在转移过程中适应能力更强,在到达远处转移前生态位重新激活时也更易存活[16],而miRNA也可能参与调控乳腺癌细胞的EMT[17]。本研究中,miR-619-5p过表达后,乳腺癌细胞中促EMT分子Snail或间充质标志物N-cadherin和Vimentin的表达下降,但上皮标志物E-cadherin的表达上调;在miR-619-5p低表达组的结果相反,上述结果均证明miR-619-5p能使乳腺癌细胞的EMT进程受阻,从而抑制乳腺癌细胞的迁移侵袭。

进一步利用生物信息学对miR-619-5p作用的下游分子机制进行初步探索,发现miR-619-5p的靶基因主要与cAMP信号通路(hsa04024)、代谢通路(hsa01100)、cGMP-PKG信号通路(hsa04022)、TGF-β信号通路(hsa04350)、TNF信号通路(hsa04668),Toll样受体信号通路(hsa04620)等相关。在miR-619-5p的靶基因中,CREB1是一种转录因子,通过与DNA的cAMP反应元件(CRE)结合刺激转录,其异常表达与细胞周期、增殖、分化和肿瘤发生发展过程中的其他生物学过程密切相关。既往研究表明,CREB1在乳腺癌中高表达,CREB1沉默对乳腺癌细胞的增殖有一定的抑制作用[18]。在本研究中,通过生物信息学分析同样表明CREB1在乳腺癌中低表达,且其表达与临床患者的无复发生存率密切相关。CREB1可受miR-619-5p调控,因此推测,在乳腺癌中miR-619-5p可通过下调CREB1发挥作用。

综上所述,本研究首次报道了miR-619-5p在乳腺癌中发挥的生物学作用,即miR-619-5p能抑制MDA-MB-231与MCF-7乳腺癌细胞的增殖活性、迁移、侵袭能力和EMT过程,其作用可能通过靶向调控CREB1实现。接下来我们将进一步验证miR-619-5p是否直接靶向CREB1进而调控其他信号通路来抑制乳腺癌侵袭与转移,为临床诊断和治疗乳腺癌提供新的参考。