GC×GC-TOFMS结合化学计量学解析传统型半干黄酒的挥发性陈化标志物质

刘少璞，周志磊，俞红波，茅来根，潘兴祥，姬中伟，毛 健,3,5,*

（1.江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏 无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3.江南大学（绍兴）产业技术研究院，浙江 绍兴 312000；4.浙江塔牌绍兴酒有限公司，浙江 绍兴 312000；5.国家黄酒工程技术研究中心，浙江 绍兴 312000）

黄酒与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒，是独具中国特色的传统发酵酒[1]，按产品风格可分为传统型黄酒、清爽型黄酒和特型黄酒[2]，其中传统型半干黄酒是最为流行的黄酒产品类型，主要产区为浙江绍兴地区。黄酒又称老酒，陈化是传统型半干黄酒的关键工序，通常需要经过5 a以上的长期陶坛贮存[3]。陈化期间陶坛内发生了酯化、美拉德和氧化等一系列物理化学反应[4]，使黄酒的香气逐渐变得浓郁协调，不同陈化时间的黄酒风味差异很大，往往被赋予不同的价值，解析陈化过程中黄酒的组分变化规律及标志性成分对于黄酒品质评估和质量控制具有重要意义。

陈化黄酒香气的改变主要由挥发性组分的变化引起，近红外光谱[5]、核磁共振波谱[6]、电子鼻[7]和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]等技术的发展为挥发性组分的解析提供了支撑，其中GC-MS应用最为广泛[9]。顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）提取技术具有简单快速、无需溶剂和灵敏度高等优势，常与GC-MS结合使用[9]。然而，一维GC-MS存在峰容量不足等缺陷，全二维气相色谱技术（comprehensive twodimensional gas chromatography，GC×GC）通过二维短色谱柱的进一步分离，能够解决一维保留时间相同、二维保留时间不同的化合物的共流出问题，近年来已成为挥发性组分解析的强力工具[1]。GC×GC通常与单四极杆质谱（single quadrupole mass spectrometry，qMS）和飞行时间质谱（time of flight mass spectrometry，TOFMS）联用，后者具有更高的分辨率、灵敏度、扫描速率和更大的质量范围等优势，在复杂食品体系中具有更强的定性能力[10-11]。Yu Haiyan等[12]使用液液萃取结合GC×GCqMS在绍兴黄酒中鉴定出145 个物质，Zhou Zhilei等[13]使用HS-SPME-GC×GC-TOFMS在绍兴黄酒中鉴定出232 个物质。

化学计量学能够实现GC×GC-TOFMS大数据集的深度挖掘，适合复杂体系的解析[14-16]。凌与听等[17]使用HS-SPME-GC×GC-TOFMS结合偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）在古井贡酒中筛选出50 个酒龄相关化合物。Yu Haiyan等[18]使用液液萃取结合GC×GC-qMS在不同年份绍兴黄酒中鉴定出144 个物质，结合单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）筛选出63 个重要化合物。然而，由于GC×GC-qMS分辨率的限制，一些微量化合物的检测存在不足，它们对黄酒陈化的影响可能被忽视。

本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技术对传统型半干黄酒陈化过程中挥发性组分的变化进行解析，并采用化学计量学方法筛选出具有代表性的传统型半干黄酒陈化标志物质，以期为理解黄酒陈化过程、评估黄酒品质及酒龄鉴别提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所用传统型半干黄酒样品由中国绍兴某黄酒企业提供，均为未添加焦糖色素且未经勾调的半干型黄酒，酒龄分别为1、3、6、9、12 a和15 a。为减少不同年份样本之间其他因素的影响，每个年份样品均来自于4 个不同批次，共24 个样品。

C7～C30正构烷烃、2-辛醇（色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司；氯化钠、乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂上海有限公司。

1.2 仪器与设备

Pegasus®GC-HRT+ 4D全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱仪 美国LECO公司；PAL RTC自动进样系统（配有孵化加热搅拌模块） 瑞士C T C Analytics AG公司；TR-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Thermo Fisher公司；Rxi-17sil MS色谱柱（2 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Restek公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维 美国Supelco公司；Mili-Q型超纯水仪 美国Millipore公司；ME204TE型分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME提取黄酒中的挥发性化合物

参照文献[1]报道方法进行。取3 mL黄酒样品与3 mL超纯水于20 mL顶空瓶中，加入3 g氯化钠和10 μL内标（82 mg/L 2-辛醇溶液）后迅速旋上瓶盖。样品由PAL RTC系统自动进样，平衡15 min后吸附30 min，萃取温度50 ℃，解吸时间5 min。

1.3.2 GC×GC-TOFMS仪器条件

GC×GC条件：一维色谱柱TR-FFAP，二维色谱柱Rxi-17sil MS。进样口温度250 ℃，不分流进样。以高纯氦气作为载气，恒流模式流量1 mL/min。初始温度40 ℃保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升温至230 ℃并保持7 min。调制器调制时间4 s，热脉冲时间1.2 s。二维柱温箱的温度全程比一维柱温箱高5 ℃。

TOFMS条件：电子电离源；电离能量70 eV；离子源温度280 ℃；传输线温度240 ℃；检测器电压1 400 V；质量扫描范围为33～400 u；采集频率100 spectrum/s。

1.4 数据处理

1.4.1 GC×GC-TOFMS定性及半定量分析

使用LECO ChormaTOF软件采集和处理GC×GCTOFMS数据。将一维和二维的峰宽分别设置为1 s和0.06 s进行自动积分解卷积，与NIST 2017和Wiley 9数据库进行谱库比对，识别相似度大于700的色谱峰。C7～C30正构烷烃与样品在相同条件下进样以计算每种化合物的保留指数（retention index，RI），并与NIST在线数据库（https://webbook.nist.gov/）中RI参考值比对，取RI相差50以内的化合物。最后取每组样品中出现率在50%以上的化合物作为定性结果。定性后的化合物使用内标法进行半定量分析。

1.4.2 化学计量学分析

使用化学计量学对不同年份传统型半干黄酒的GC×GC-TOFMS数据进行深度挖掘，通过对数据进行预处理可以过滤无关变量和冗余变量以提高数据分析的效果及准确性。缺失值过多会给后续分析带来困难，根据“80%规则”对所有样本中缺失值大于20%的变量进行过滤。使用内标对变量进行半定量分析以减小提取和检测过程中产生的系统性差异，并采用基于机器学习的K最邻近（K-nearest neighbor，KNN）算法对剩余少量缺失值进行插补，以便后续的单变量分析和多变量分析。

多变量分析前，可进行单变量分析删减剩余变量中无意义统计学的变量，初步筛选可能重要的化合物[15]。对于单变量分析，使用SPSS 27.0进行单因素ANOVA和Pearson相关性分析，使用错误发现率（false discovery rate，FDR）对ANOVA的P值进行校正，以减少假阳性结果的出现。根据ANOVA中P＜0.05和Pearson相关系数|r|＞0.6为条件进行变量的初步筛选。其中r值介于-1～1之间，r＞0表示正相关，r＜0表示负相关，r的绝对值越高表示相关性越强，表示随着陈化时间的延长，化合物含量更趋近于线性变化，一般可划分为不相关或弱相关（|r|=0～0.4）、中等程度相关（|r|=0.4～0.6）、强相关（|r|=0.6～0.8）和极强相关（|r|=0.8～1.0）[19]。

变量经初步筛选后进行多变量分析。对数据进行单位方差缩放后，使用SIMCA-P 14.1进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和PLS-DA。使用MetaboAnalyst 5.0在线分析平台（https://www.metaboanalyst.ca/）进行K-means聚类算法分析。使用OriginPro进行聚类热图的绘制。

2 结果与分析

2.1 不同年份传统型半干黄酒挥发性组分鉴定

为探究陈化过程对传统型半干黄酒挥发性化合物总数和类别的影响，选择6 个年份未经勾调的黄酒进行分析。采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技术解析传统型半干黄酒的挥发性组分特征，不同年份传统型半干黄酒共鉴定出351 个挥发性化合物，包括醇类49 个、酸类21 个、酯类88 个、醛类29 个、酮类36 个、酚类11 个、呋喃类18 个、内酯类10 个、萜类15 个、芳香族化合物25 个、含氮化合物23 个、含硫化合物10 个和其他化合物16 个，其中有40 个主要化合物在中国黄酒中被首次鉴定，如表1所示。

表1 采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS在中国黄酒中首次鉴定出的主要挥发性组分Table 1 Major volatile compounds identified in Huangjiu for the first time by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

如图1所示，15 a陈酒（1 963 个，图1B）较1 a新酒（1 197 个，图1A）具有更为丰富的挥发性组分。不同年份传统型半干黄酒中挥发性化合物的类别和数目统计如表2所示，1 a新酒和15 a陈酒分别鉴定出225 个和304 个化合物，后者约为前者的1.35 倍。黄酒的挥发性化合物总数随陈化时间延长整体呈上升趋势，说明长期陶坛陈化过程能够丰富黄酒的挥发性物质组成，与其他酒类挥发性组分陈化研究结论相似。Yu Haiyan等[12]使用GC×GC-qMS在5 a陈和10 a陈的黄酒中分别检测到98 个和107 个化合物，凌与听等[17]发现陈年白酒的微量风味组分数量增加。有31 个化合物仅在高年份陈酒（15 a）样本中检出，如2,6-二乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-戊烯-2-酮、2-壬烯-4-酮、3-壬烯-2-酮和香草乙酮等，它们可能是在陈化过程中生成的物质，对高酒龄黄酒的风味可能具有特殊的贡献。随着陈化时间延长，酸类、酯类、醛类、酮类、呋喃类、内酯类和含氮化合物数量整体增加，酚类、萜烯及其衍生物类数量整体减少，醇类化合物的数量先减少后增加，这可能与酯化、美拉德和氧化等反应的发生有关[4]。

图1 酒龄1 a（A）和15 a（B）黄酒的GC×GC-TOFMS总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of GC×GC-TOFMS of oneyear-old (A) and 15-year-old (B) Huangjiu

表2 不同年份传统型半干黄酒中按类别统计的挥发性化合物数目Table 2 Number of volatile compounds in traditional semi-dry Huangjiu of different ages

2.2 传统型半干黄酒挥发性物质随陈化时间的变化规律

对所有样本进行缺失值过滤，删减后得到223 个化合物进行单变量分析。使用FDR对P值校正后的单因素ANOVA显示，其中有198 个化合物在陈化过程中含量发生显著变化（P＜0.05），并对其进行Pearson相关性分析。结果显示，共有44 个不相关或弱相关的化合物（|r|=0～0.4）、47 个中等程度相关的化合物（|r|=0.4～0.6）、84 个强相关性的化合物（|r|=0.6～0.8）和23 个极强相关性的化合物（|r|=0.8～1）。初步筛选出107 个重要化合物，其同时满足缺失值小于20%、ANOVA显著（P＜0.05）及Pearson相关性较强（|r|＞0.6）3 个条件，包括醇类8 个、酸类12 个、酯类33 个、醛类11 个、酮类5 个、呋喃类10 个、酚类3 个、内酯2 个、萜烯2 个、芳香族7 个、含氮化合物6 个、含硫化合物3 个和其他化合物5 个。107 个化合物中有95 个化合物在陈化过程中含量显著增加，12 个化合物含量显著减少。油酸乙酯、戊二酸二乙酯和水杨酸乙酯等30 个酯类物质含量的增加可能与酯化反应有关，2-丙酰呋喃、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛等呋喃类物质含量的增加可能与美拉德反应有关[4]。此外，55 个化合物首次被发现在陈化过程中含量显著变化，按r值高低排序如表3所示。

表3 在中国黄酒陈化过程中首次被发现存在显著含量变化的55 个化合物的Pearson相关系数r值、FDR校正后ANOVA的P值和含量Table 3 Pearson correlation coefficients (r), FDR-corrected P-values of ANOVA, and contents of 55 compounds that significantly changed during the aging process of Huangjiu identified for the first time

2.3 基于无监督多变量分析的不同年份传统型半干黄酒挥发性组分特征

化学计量学中的多变量分析一般分为非监督和有监督2 种方式，非监督多变量分析通常用于数据的初步探索，主要方法包括PCA和聚类分析等[15]。因此，对上述筛选出的107 个重要化合物进行PCA、HCA和K-means聚类分析，以探究不同年份传统型半干黄酒样本之间的相似性，结果如图2所示。PCA结果显示，PC1和PC2共解释了84.0%的总方差，得分图中不同年份黄酒样本组之间产生明显的分离，说明不同年份黄酒样本具有一定的差异（图2A）。HCA结果表明，黄酒样品被聚为三大类，第1类为1 a陈和3 a陈的黄酒，第2类为6、9 a陈和12 a陈的黄酒，第3类为15 a陈的黄酒（图2B）。同时使用K-means聚类算法（K=3）对HCA结果进行验证，聚类结果在图2A中以不同颜色和椭圆范围表示，结果显示K-means聚类情况与HCA相同。以上结果表明，传统型半干黄酒的长期陶坛陈化进程可大致分为3 个阶段，即短期陈化（1～3 a）、中期陈化（6～12 a）和长期陈化（15 a及以上）。

图2 不同年份传统型半干黄酒挥发性组分的PCA与K-means聚类分析组图（A）和HCA树状图（B）Fig.2 Integrated PCA and K-means cluster analysis plots (A) and HCA dendrogram (B) of volatile compounds in traditional semi-dry Huangjiu of different ages

2.4 基于有监督多变量分析的传统型半干黄酒的陈化标志物质筛选

PLS-DA是一种有监督的多变量分析方法，可以用来筛选对于样品分类具有突出贡献的变量。使用上述筛选出的107 个重要化合物建立了PLS-DA模型，结果如图3所示。在得分图中可以观察到不同样本组之间的分离，说明PLS-DA模型可以区分不同年份的传统型半干黄酒（图3A）。PLS-DA模型载荷图可以评估导致样品组间差异的特定挥发性化合物，可以看出大量化合物与高年份样品组密切相关（图3B）。使用交叉验证和置换检验评估模型性能。k折交叉验证（k=7）结果显示，模型R2X=0.964，R2Y=0.977，Q2=0.890，表示该模型具有良好的鲁棒性和预测能力。置换检验（n=200）中R2Y和Q2的截距分别为0.575和-0.897，Q2截距＜0.05，说明PLS-DA模型没有过拟合（图3C）。

图3 不同年份传统型半干黄酒挥发性组分的PLS-DAFig.3 PLS-DA of volatile compounds in traditional semi-dry Huangjiu of different ages

为探究PLS-DA模型中对区分不同样本组具有突出贡献的变量，计算它们投影中变量重要性（variable importance in projection，VIP）值，VIP值大于1且值越高说明该变量对区分样本组的贡献越大。图3D结果表明，共有37 个化合物的VIP值大于1，其VIP值和Pearson相关系数r值如表4所示，它们对不同陈化时间的区分具有重要贡献，是传统型半干黄酒的陈化标志物质。使用聚类热图表示37 个陈化标志物质的含量变化（图4），样本的层次聚类结果表示在上轴的树状图中，可以看出样本仍分为短期陈化、中期陈化和长期陈化3 大类，与2.3节实验结果一致。变量的层次聚类结果表示在左轴的树状图中，37 个陈化标志物质共分为两大类，第1类为在陈化过程中含量减少的12 个化合物，如土臭素、二苯基甲烷和苯乙醛二乙缩醛等。第2类为含量增加的25 个化合物，如2-糠醛缩二乙醇、2-丁基-2-辛烯醛和邻苯二甲醚等。

图4 PLS-DA模型中VIP值大于1的37 个陈化标志物的聚类热图Fig.4 Cluster heatmap of 37 aging markers with VIP > 1 in PLS-DA

表4 37 个陈化标志物质的PLS-DA模型VIP值、Pearson相关系数r值和FDR校正后ANOVA的P值Table 4 VIP values in PLS-DA, Pearson correlation coefficients (r) and FDR-corrected P-values of ANOVA of 37 aging markers

为进一步筛选最具代表性的陈化关键标志物质，以VIP＞1和Pearson相关系数|r|＞0.8（极强相关）为条件对上述37 个标志物质进行最终筛选，得到了10 个化合物作为传统型半干黄酒的陈化关键标志物质，包括6 个含量减少的物质（癸酸乙酯、2-戊基呋喃、丁酸异戊酯、丁酸乙酯、丁酸和2-糠醇）和4 个含量增加的物质（4-乙基苯酚、2-乙酰基-5-甲基呋喃、邻甲酚和5-甲基糠醛）。

传统型半干黄酒中有4 个呋喃类陈化关键标志物质，其中2-戊基呋喃具有坚果香[13]，是酿酒原料蒸煮后的重要香气成分[20]，黄酒的蒸饭工艺可能是其产生的原因，可作为新酿黄酒的标志物质[21]。2-糠醇首次发现为黄酒陈化标志物质，其含量持续减少的原因可能有：1）参与乙基糠基醚（P＜0.001，r=0.514）的形成[22]；2）在酸性条件下形成棕色的脂肪族糠醇低聚物，并可能进一步参与类黑精的形成[23]；3）氧化反应形成2-糠醛（P＜0.05，r=0.500）[24]。5-甲基糠醛和2-乙酰基-5-甲基呋喃具有焦糖与焙烤般的香气，它们在陈化过程中显著增加，可能与美拉德等非酶褐变反应有关[21,25]。5-甲基糠醛已被证明为黄酒的陈化标志物质[4,21]，而2-乙酰基-5-甲基呋喃是浓香型白酒的产地区分标志物质[25]，本研究发现其同样为黄酒的陈化标志物质。

陈化关键标志物质中有3 个酯类物质，其中癸酸乙酯和丁酸乙酯被其他研究报道为酒龄标志物，在黄酒陈化过程中呈显著减少趋势[4,21]。丁酸异戊酯在黄酒中报道极少，它是白酒[26-27]、葡萄酒[28-29]、白兰地[30-31]等其他酒类中的重要香气物质，且被证明是区分不同发酵方式桃红葡萄酒的标志物质[28]，本研究首次证明其为黄酒陈化过程中显著减少的标志物质。通常情况下，黄酒中酸类与醇类物质在陈化期间发生酯化反应会导致酯类物质含量增加[4]，然而上述3 个酯类化合物却表现出减少的趋势，可能是发生了水解[32-33]或氧化[34]等反应。

2 个酚类陈化关键标志物质的含量在陈化过程中增加，其中4-乙基苯酚的增加趋势与Wang Na等[21]的报道不同，但在葡萄酒[35]和啤酒[36]中存在陈化中增加的现象，可能与黄酒中存在的对香豆酸和阿魏酸等羟基肉桂酸类物质的转化有关[37-38]。邻甲酚是首次在中国黄酒中鉴定出的微量化合物，并在本研究中被证明是传统型半干黄酒的陈化标志物。丁酸的减少趋势与Chen Shuang等[3]发现的结果不同，但在其他关于黄酒[12]、白酒[39]和葡萄酒[40]陈化的研究中有趋向减少的报道，可能与醇和酸之间的酯化反应有关。

3 结 论

本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技术对不同年份传统型半干黄酒的挥发性组分进行全面解析，鉴定出了大量的微量挥发性化合物。陈化过程中挥发性物质总数呈增加趋势，其中107 种化合物含量发生显著变化且与陈化时间相关性较强。化学计量学分析发现传统型半干黄酒的陈化进程可以分为短期、中期和长期陈化3 个阶段。最终筛选得到37 个陈化标志物质，其中10 个为关键标志物质。丁酸异戊酯、丁酸、2-糠醇、2-乙酰基-5-甲基呋喃和邻甲酚5 种化合物首次被鉴定为黄酒陈化关键标志物质，它们在陶坛陈化期间的含量变化可能涉及水解、酯化、氧化和美拉德等多种反应，并可能受到温度和氧气等环境因素的影响，其含量变化机制及对黄酒陈化风味的影响值得进一步研究。