小柴胡颗粒的研究进展与质量标志物预测分析

付国辉, 黄丽杰, 岳 磊, 刘娜娜, 闫懿高

(1.河南医学高等专科学校药学院中药教研室,郑州 451191; 2.郑州市食品药品检验所,郑州 450000)

小柴胡颗粒是一个由多味药材组成的复方中成药制剂,其组方有柴胡、黄芩、姜半夏、党参、生姜、甘草和大枣七味药材。小柴胡颗粒组方来源于东汉名医张仲景的医学著作《伤寒杂病论》中的经典和解剂名方小柴胡汤。小柴胡汤中所用人参在小柴胡颗粒中替换成了党参,且在小柴胡颗粒中增大了大枣的用量。小柴胡颗粒有解表散热、疏肝和胃的功能,临床上主要用于外感病,邪犯少阳证,常见病症有寒热往来、胸胁苦满、食欲缺乏、心烦喜呕和口苦咽干等。

小柴胡颗粒的标准虽已建立,但对其研究仍在继续,且存有争议之处。参考2020年版《中国药典》一部可知,在其含量测定项下仅以黄芩苷一个化合物作为指标性成分,而黄芩苷主要存在于臣药黄芩中,作为君药且用量最大的柴胡却没作任何规定,评价指标略显单薄。因此,其检验检测评价标准仍有值得研究之处。

在查阅大量文献的基础上,通过反复确证,最终以中药质量标志物(Q-marker)模式对小柴胡颗粒进行考察。自2016年刘昌孝院士提出中药质量标志物[1]概念以来,利用此模式对中药材、中药饮片及中成药进行研究的文献逐年增多,如今距此概念提出已达六年之久,该模式已得到了较为普遍的推广,经受住了时间和研究者们的考验,显示了其创新性和科学性。本文基于该模式中的“五要素”对小柴胡颗粒进行质量标志物的预测分析,为科学、系统、综合和全面地评价小柴胡颗粒提供充足的理论依据。

1 化学成分

化学成分是中药起效的物质基础,化学成分种类和含量的差异直接影响到药物的治疗效果。当其具备的条件成熟,中药成分就能成为反映中药质量的标志物(quality marker,Q-markers)[1]。截至目前,无论是水提取部位或是醇提取部位,均尚未发现对小柴胡颗粒复方制剂的化学成分研究,化学成分研究局限于单味药材和复方制剂颗粒中多成分的含量同时测定。马蓉等[2]利用超高效液相色谱-质谱(UHPLC-MS)技术分离鉴定出66种化学成分。张慧等[3]利用高效液相色谱(HPLC)紫外单波长法对小柴胡颗粒中7种指标性成分进行了同时测定,包括甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、柴胡皂苷a和汉黄芩素。张雪等[4]基于小柴胡颗粒的生产工艺制备小柴胡颗粒基准样品,采用UPLC法建立小柴胡颗粒中8种化学成分的含量测定方法,包括柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草苷、甘草皂苷G2和甘草酸。庄延双等[5]建立了小柴胡颗粒的特征图谱并同时测定了5种指标性成分的含量,包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和甘草次酸。王嘉林等[6]采用HPLC-MSMS法测定了小柴胡颗粒中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。基于以上研究,预测柴胡皂苷a(SSa)、柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷d(SSd)、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷、甘草酸、甘草次酸和甘草皂苷G2可能作为小柴胡颗粒的质量标志物。

2 药理作用

2.1 调节免疫、抗肿瘤 赵艳玲[7]发现,在对52例感染性心肌炎患者在常规治疗的基础上加用小柴胡颗粒进行治疗后,外周血T淋巴细胞亚群中(CD3+、CD4+、CD8+)及NK水平提高,心肌酶谱指标中血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)水平降低,心肌损伤的特异性标志物肌钙蛋白I和肌钙蛋白T水平均降低,表明小柴胡颗粒能减轻心肌损伤,增强细胞的免疫功能,提高临床有效率。小柴胡颗粒具有明显提高机体免疫力的作用,而免疫系统在抗肿瘤中发挥着重要作用[8]。张军能等[9]通过建立小鼠lewis肺癌模型,比较小柴胡颗粒治疗组和磷酸盐缓冲液(PBS)灌注组小鼠的生存率、荷瘤大小、肿瘤转移情况及肿瘤相关细胞因子表达的差异,结果表明与磷酸盐缓冲液(PBS)灌注组小鼠相比,小柴胡颗粒治疗组小鼠的生存率明显提高,肺部病灶转移少,腹腔巨噬细胞吞噬活性增强,脾脏分泌的细胞因子TNF-α(抗肿瘤活性最强因子)、IFN-γ(提高NK细胞的活性因子)和IL-2(提高T细胞抗肿瘤活性因子)升高,IL-4(抑制T细胞活性因子)下降,表明小柴胡颗粒是通过提高天然免疫细胞的杀伤力,增加抗瘤细胞因子的分泌达到抗肿瘤作用。

2.2 抗炎保肝 张旭等[10]运用小柴胡颗粒对28例重度全身性感染性肾损伤患者进行治疗后发现,脏器功能指标血清胱抑素C(CysC)和急性炎症指标血清降钙素原(PCT)水平均降低,表明小柴胡颗粒具有较好的抗炎作用。贾为壹等[11]使用硫代乙酰胺(TAA)造模大鼠急性肝损伤,通过小柴胡颗粒的治疗,确定大鼠病变范围和程度均有所改善,研究发现是因激活了Nrf2信号通路和下游分子醌氧化还原酶1(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸合成酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸半胱氨酸合成酶调节亚基(GCLM)的信使RNA和蛋白表达,对急性肝损伤具有良好的治疗作用。

2.3 退热 马蓉等[2]在小柴胡颗粒中确证了66种化合物,筛选出68个潜在退热靶点,对7个关键靶点进行验证,研究显示小柴胡颗粒退热机制与机体多个发热环节相关联,具有很好的退热效果。毕聪等[12]基于网络药理学的组方配伍规律解析了小柴胡颗粒的退热作用及其机制,研究发现27个肿瘤坏死因子信号通路,确证了5个由7味药材共同作用的核心靶点核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白1(AP-1)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和胱天蛋白酶3(CASP3)组成的多靶点协同退热治疗。

3 临床应用

3.1 上呼吸道感染 翟登合等[13]观察小柴胡颗粒联合蒲地蓝消炎口服液对治疗上呼吸道感染的影响,结果显示患者治疗总有效率可达95.0%,症状消失时间明显缩短。在给予患者阿奇霉素片常规治疗的基础上,加用小柴胡颗粒和连花清瘟胶囊进行治疗,结果显示联合小柴胡颗粒和连花清瘟胶囊治疗的效果优于单独使用阿奇霉素片,血常规(白细胞计数、中性粒细胞比例)和血清干扰素-γ(IFN-γ)均较低,有效提高了临床疗效[14]。陈瑛[15]选取110例流行性上呼吸道感染患者为研究对象,随机分为观察组和对照组,各55例,观察组给予小柴胡颗粒,对照组给予酚咖片,疗程为3 d,观察治疗结果,发现2组免疫功能指标(CD3+、CD4+、CD4+/CD8+)均显著提高,炎症指标(中性粒细胞计数、白细胞计数)、血清C反应蛋白(CRP)及体温均降低明显,但观察组效果更佳,且治疗过程中未出现明显不良反应,提示安全性较高,说明小柴胡颗粒治疗上呼吸道感染有较大优势。

3.2 慢性支气管炎 姜振[16]探讨小柴胡颗粒在治疗慢性支气管炎患者中的作用,联合羧甲司坦口服溶液治疗一周后,患者的咳痰、发热、肺部啰音和咽喉疼痛症状均明显消失或减轻。刘珊珊等[17]研究发现,在服用小柴胡颗粒联合盐酸氨溴索注射液治疗2周后,患者呼吸状况和肺功能(FEV1、FEV1%)明显改善,治疗效果较佳。在对慢性支气管炎急性发作期的治疗中,小柴胡颗粒联合盐酸氨溴索雾化吸入方式治疗取得了良好的临床效果,与治疗前相比,患者在临床有效率、临床症状消失时间、肺功能变化、炎症因子水平(IL-6、IL-8、TFN-α)的变化等方面都取得了满意效果,该联合用药,有明显缩短临床症状、提高临床效率、提升肺功能和显著降低炎症因子水平等优势[18]。李玉辉等[19]用Meta分析法对5篇文献进行探究,考察小柴胡颗粒联合西药治疗慢性支气管炎的效果,结果发现联合用药治疗总有效率均显著提高,其他常见指标均取得满意效果,且在治疗同时配合体育疗法,可实现延长患者复发时间间隔、增强患者呼吸系统功能和减少组织破坏等效果[20]。

3.3 胃食管反流 方向前[21]研究在使用莫沙比利与奥美拉唑联合治疗胃食管反流病(GERD)的基础上加用小柴胡颗粒进行治疗。结果三药联用显示出更高的治愈率和总有效率,临床效果显著。有研究[22]还发现,在使用泮托拉唑和莫沙比利治疗的基础上加用小柴胡颗粒治疗反流性食管炎(RE),能较好地改善患者的生活质量和抑郁水平。还有西药联合小柴胡颗粒和左金丸共同治疗胃食管反流病的临床研究,均取得良好的临床效果[20]。

3.4 联合用药 李兆华等[23]采用厄贝沙坦联合小柴胡颗粒治疗慢性肾功能不全,结果显示患者24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平均显著降低,总有效率显著升高,联合用药可从多途径改善肾功能,从局部和整体对患者进行综合治疗。黄峰等[24]发现小柴胡颗粒联合大黄粉胶囊治疗重型肝炎,可以明显改善重型肝炎症状,降低并发症的发生率,提高生存率,且小柴胡颗粒的抗纤维化作用在治疗重型肝炎中意义重大。余黄鹏等[25]临床探讨小柴胡颗粒联合高效抗反转录病毒治疗(HAART)方式治疗艾滋病,研究显示小柴胡颗粒可降低由HAART治疗引起的不良反应,提高患者免疫力、服药依从性和生活质量。王荣[26]在通过临床分组研究胆囊切除术后综合征的治疗中发现,小柴胡颗粒联合马来酸曲美布汀和盐酸多塞平共同治疗比单纯使用马来酸曲美布汀和盐酸多塞平治疗可提高治疗总有效率,症状积分降低,显著改善了患者的临床症状。廖观全[27]观察小柴胡颗粒联合马来酸曲美布汀片治疗肠易激综合征(IBS),比较联合用药和仅使用马来酸曲美布汀片治疗前后的IBS-SSS评分及疗效,结果显示联合用药IBS严重程度量表(IBS-SSS)评分较低,临床症状显著改善,体现了中西医结合治疗的特色。

3.5 其他临床用药 李素那等[28]将使用小柴胡颗粒治疗经期外感的患者临床结果与使用酚麻美敏片治疗的38例患者临床结果进行对比观察,结果显示与服用酚麻美敏片相比,服用小柴胡颗粒治疗经期外感疗效显著。张钰[29]在临床治疗中发现,小柴胡颗粒配合其他汤剂使用可使风热感冒患者病情得到快速好转。林鸣[30]研究发现,服用小柴胡颗粒并结合外治法治疗体虚风寒感冒可以取得很好的疗效,如结合拔火罐、照神灯等治疗比单纯使用小柴胡颗粒治疗疗程更短。在对复发性口疮复发率的影响研究中发现,随访2年后的结果显示,使用小柴胡颗粒治疗复发性口疮可以显著降低复发率,并显著优于目前使用的常规治疗方法。

4 质量标志物预测分析

自中药质量标志物提出以来,已经产生了不少科研理论和实践成果,此概念在中药研究领域愈加显示出其独特的分析研究视角,为建立全新的药物质量管理体系发挥了重要作用。小柴胡颗粒组方配伍独特,兼具祛邪扶正、透表清里和疏肝治脾的功效,性平,和缓,顾全局。本文依据Q-marker“五要素”中的“中药功效-作用机制关联性”“生物学-有效性、安全性”“质量物质可测性”和“质量标准稳定性”等原则对小柴胡颗粒质量标志物进行预测分析,以期为其全面研究提供参考。

4.1 基于中药成分特有性的Q-marker预测分析

4.1.1 柴胡 柴胡为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld. 的干燥根。又习称“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡的主要化学成分有皂苷类、挥发油、多糖、甾醇和黄酮等,还有其他如多元醇、香豆素、脂肪酸等十多类成分[31]。柴胡皂苷为皂苷类的主要活性成分,其中有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f等150多种柴胡皂苷[32]。温度和pH值对柴胡皂苷的提取有很大影响,有研究[33]发现,I型原生皂苷中SSa、SSd等结构不稳定,尤其在高温或酸性条件下,环氧醚键断裂后转化为Ⅱ型柴胡皂苷B1和B2等次生皂苷,对提取工艺要求较为严格,适宜在低温及碱性条件下进行提取;以醋炮制后总皂苷含量下降,用蜜炮制后总皂苷含量升高明显[34]。因此,在进行药物质量控制与评价时,应综合考虑提取工艺对药物内部化学成分的影响,以免造成误判。《中国药典》仅规定了北柴胡的含量测定指标性成分,规定含SSa和SSd的总量不得少于0.30%[35]。作为柴胡的有效成分之一,挥发油的研究目前仅停留在成分的分析鉴定研究阶段。李勇慧等[36]在柴胡中共分析鉴定出64种挥发油成分,分别为酸类、酯类、酮类、醇类和烷羟类化合物,含量较大的成分有(Z,Z)-9,12-十八烯酸、十八烯酸、n-十六烷酸、邻苯二甲酸二丁酯、1-(2-羟基-4-甲氧基苯基)-乙酮和Z-5-甲基-6-二十一碳烯-11-酮等。目前仅有王鹏等[37]关于柴胡中挥发油含量测定的报道,利用重量法对不同采收期的柴胡中挥发油总成分进行测定,且与此相关联的体内药效学和药代动力学研究也很少,若作为评价柴胡的指标性成分,还需要做进一步的探索研究。柴胡中活性成分多糖类,据文献报道[38-39],主要单糖有阿拉伯糖和半乳糖,以及木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖醛酸等,目前并无柴胡多糖的含量测定报道。甾醇类也是柴胡的有效活性成分,主要有β-菠甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角-7-烯醇葡萄糖苷等[40]。黄酮类作为活性成分之一,主要大量存在于柴胡地上部分,有芦丁、异鼠李素及异鼠李素糖苷类、山奈酚及山奈酚糖苷类、槲皮素及槲皮素糖苷类和曲克芦丁等成分,梅赞等[41]测定了4种柴胡地上部分中6种黄酮类成分(芦丁、广寄生苷、水仙苷、槲皮素、山柰素、异鼠李素)的含量,可为柴胡地下部分黄酮类成分含量研究提供借鉴。综上可知,柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f可作为柴胡Q-marker的目标化合物。

4.1.2 黄芩 黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。黄芩主要化学成分有黄酮类、多糖类、挥发油和甾类等。据现有文献报道[42-44],黄芩中黄酮类特异性活性成分主要有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、野黄芩苷、白杨素、千层纸素A、芹菜素、木犀草素、异红花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、韧黄芩素-I、黄芩黄酮-Ⅱ等。牛宇龙等[45]采用HPLC法测定黄芩中6种黄酮类化合物的含量,其中黄芩苷的含量最高,黄芩素次之,其次为汉黄芩素、野黄芩苷、千层纸素A和白杨素。房佳敏等[46]收集4个不同产地的黄芩样品,对其中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素4种成分进行含量测定,并考察黄芩提取物中化学成分含量高低对A549肺癌细胞的抑制作用,结果发现A549肺癌细胞的存活率与黄芩提取物中化合物呈浓度依赖性,化合物含量越高,A549肺癌细胞存活率越低,表明黄芩提取物中化学成分具有抑制肺癌细胞增值的效果。《中国药典》中黄芩药材以黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素作为黄芩药材的定性鉴别指标,含量测定指标性成分为黄芩苷,规定含量不得少于9.0%[47]。综合分析,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、野黄芩苷、千层纸素A和白杨素可作为黄芩Q-marker的目标化合物。

4.1.3 半夏 半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎。为常用有毒中药,化学成分有生物碱类、有机酸类、氨基酸类、挥发油、苯丙素类、黄酮类和糖类等[48-49]。临床所用半夏炮制品有生半夏、法半夏、姜半夏和清半夏,小柴胡颗粒组方所用半夏为姜半夏,引入生姜强化了半夏的止呕作用,弱化了化痰和止咳作用。现代临床及药理学有研究[50]表明,与炮制前相比,炮制后的姜半夏中生物碱(麻黄碱、胆碱、葫芦巴碱、核苷类)、蛋白类(鸟苷、尿苷、腺苷)、多糖、草酸钙和β-谷甾醇含量均有所降低,有机酸含量升高[51]。半夏中生物碱具有镇咳祛痰和抗癫痫等作用,半夏多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用,有机酸具有镇咳祛痰、平喘、止泻等作用,半夏蛋白具有抗早孕、抗凝血作用,而半夏生物碱、有机酸、多糖、蛋白等都表现出抗肿瘤和止呕作用。据文献报道[52-53],目前对姜半夏进行测定的化学成分有肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸、6-姜辣素、盐酸麻黄碱、多糖和有机酸。《中国药典》一部并未对姜半夏作指标性成分的规定。综合分析,肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸、6-姜辣素、盐酸麻黄碱、多糖、有机酸可作为半夏Q-marker的目标化合物。

4.1.4 生姜 生姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鲜根茎。作为一种药食同源的植物,生姜的使用历史悠久,在传统医药中占有非常重要的地位。生姜的主要化学成分包括挥发油、姜辣素、二苯基庚烷类、黄酮类、氨基酸类、多糖类和微量元素等。生姜中挥发油主要分为单萜烯类及其氧化物和倍半萜烯类及其氧化物,化学成分有姜烯、α-姜黄烯、蒎烯、α-蒎烯、茨烯、水芹烯、β-水芹烯、3-(1,5-二甲基-4-己烯基)-6-亚甲基-环己烯、桉油精、龙脑、橙花醇、柠檬醛和松油醇等[54-55]。姜辣素的主要化学成分有姜酚(6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚)、姜烯酚(6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚)、姜酮酚和姜油酮、1-去氢姜辣二酮等[56-57]。刘琳琪等[54]在对从9种不同产地生姜挥发油中分离鉴定出的化学成分的分析中发现,85%～94%为单萜类和倍半萜类,且β-水芹烯和姜烯含量最高,其次为姜黄烯。《中国药典》一部[58]生姜含量测定项下规定挥发油不得少于0.12%(mg/g),6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚总量不得少于0.040%。综合分析,挥发油、β-水芹烯、6-姜辣素、姜烯、姜黄烯、8-姜酚和10-姜酚可作为生姜Q-marker的目标化合物。

4.1.5 党参 党参为桔梗科植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.、素花党参CodonopsispilosulaNannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川党参CodonopsistangshenOliv.的干燥根。目前对党参化学成分的研究已很成熟,在已分离鉴定出的二百多种化学成分中,生物碱类、聚炔类、木质素类、黄酮类和多糖被认为是主要活性成分[59]。较为常见的生物碱有党参碱、党参次碱、管花党参碱A～B、党参吡咯烷鎓B和党参脑苷脂A等;炔类及烯类成分有党参炔醇、党参炔苷、党参炔苷宁、党参二炔苷A～G、党参烯炔苷A～B、苍术内脂Ⅰ、苍术内脂Ⅱ、苍术内脂Ⅲ和党参炔A～B等;木质素类成分有党参苷Ⅰ～Ⅵ、党参苷Ⅷ、去氢双松柏醇、丁香苷、紫丁香苷和松柏苷等;酚酸和有机酸类成分有党参酸、烟酸、阿魏酸、丁香酸和绿原酸等[60]。张璐[61]采用Box-Behnken响应面分析法优化了党参中党参炔苷含量测定的提取工艺,并运用HPLC法测定了党参炔苷的含量。刘付松等[62]利用HPLC法建立了党参中5种化学成分含量测定的方法,测定并比较了不同品种及采收期党参药材中党参炔苷、丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内脂Ⅱ、苍术内脂Ⅲ的含量,结果显示不同品种和采收期药材中5种成分含量存在较大差异。陈娟等[63]测定了党参中紫丁香苷、党参炔苷和苍术内脂Ⅲ的含量,结果显示回收率高,重复性良好。《中国药典》一部[64]中党参药材无含量测定项目,仅以党参炔苷作为定性指标用以薄层色谱法中党参药材的鉴别。综合分析,党参炔苷、丁香苷、紫丁香苷、苍术内酯Ⅰ、苍术内脂Ⅱ和苍术内脂Ⅲ可作为党参Q-marker的目标化合物。

4.1.6 大枣 大枣为鼠李科植物枣ZiziphusjujubeMill.的干燥成熟果实。大枣化学成分复杂,主要化合物类型有三萜类(主要类型有羽扇豆烷型、齐墩果烷型和Ceanothane型3种)、黄酮类、糖苷类、核苷类(cAMP、cGMP)及各种氨基酸等。现已分离鉴定出的三萜类化合物有桦木酮酸、齐墩果酮酸、桦木酸、齐墩果酸、羽扇豆醇、麦珠子酸和白桦脂酮酸等[65-66]。黄酮类化合物有芦丁、当药黄素和棘苷[67]。郭盛等[68]基于一测多评法测定大枣药材中6种三萜酸类化学成分(白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、桦木酮酸、齐墩果酮酸和熊果酮酸),以白桦脂酸对照品为内参物,计算结果与各成分外标法计算所得数值相比较无显著性差异,显示该方法可行。侯广月等[69]采用HPLC二极管阵列检测器法测定大枣中齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)的含量,方法简便、快速和可靠。王福玲等[70]探讨了大枣中总黄酮的提取工艺,并以芦丁对照品为指标性成分,采用紫外分光光度法测定大枣中总黄酮的含量,该法重现性好、结果稳定。李昊月等[71]测定了4个产地大枣中18种氨基酸的含量,发现包括8种人体必需的氨基酸在内的18种氨基酸均存在于4个产地(山西汾阳、新疆和田、陕西延安、河南新郑)的大枣中,且新疆大枣中氨基酸总含量最高。此外还有多糖[72]、维生素[73]等的含量测定。《中国药典》一部[74]中大枣药材无含量测定项目,鉴别项下也未指定任何指标性成分,原因可能与至今仍未发现大枣药材中的特有化合物有关。综合分析,白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、桦木酮酸、齐墩果酮酸、熊果酮酸、cAMP、cGMP和氨基酸可暂作为大枣Q-marker的目标化合物。

4.1.7 甘草 甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根茎。甘草的主要化学成分有三萜类、黄酮类和香豆素类,此外还有多糖类、生物碱、挥发油和微量元素等。三萜类活性成分有18α-甘草酸、18β-甘草酸及甘草次酸;黄酮类主要活性成分为甘草素、异甘草素、甘草苷和异甘草苷。此外,甘草次酸为甘草酸的水解产物,三萜类成分在光果甘草中的含量最高,黄酮类在乌拉尔甘草中含量最高[75]。不同基原甘草的化学成分差异较大,为更好地在临床使用,应在使用前加以区分。陈佳等[76]探讨了新疆地区光果甘草和胀果甘草化学成分的差异性,结果发现可将新异甘草苷、异甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2及异甘草素7个化学成分作为区分2个基原甘草药材的差异性化学成分。《中国药典》一部[77]中甘草药材含量测定项下设置了2个指标性成分,分别为含甘草苷不得少于0.50%和甘草酸不得少于2.0%。综合分析,甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2可作为甘草Q-marker的目标化合物。因甘草中总黄酮和总三萜类含量在甘草种属间具有显著性差异[78],因此,建议将光甘草定作为光果甘草的特异性质量标志物,将甘草查耳酮A作为胀果甘草的特异性质量标志物。

4.2 基于成分与药效关联性的Q-marker预测分析 中药化学成分复杂,且存在初级代谢产物和次生代谢产物之分,经过生产工艺提取后中成药制剂中化学成分更加复杂多样,因此,对中成药制剂中化学成分与药效间的关联性研究变得极为重要。厘清中成药制剂中化学成分与药效之间的关系,对于药物在临床上的合理应用极具现实意义。

马蓉等[2]使用UHPLC-MS技术分离鉴定出小柴胡颗粒中66个化合物,其中包括山奈酚、柴胡皂苷B2、槲皮素、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、6-姜辣素、甘草素、甘草黄酮醇、甘草苷、甘草次酸、甘草酸、甘草皂苷G2、党参碱、丁香脂素、鸟苷和腺苷等;利用Bioinformatics &Evolutionary获取小柴胡颗粒退热潜在作用靶点68个,将其导入String数据库,采用Cytoscape软件计算核心基因,排名前十的核心基因分别为VEGFA、TNF、CCL2、CXCL8、IL-6、PTGS2、IFNG、IL-10、ICAM1和IL-1β,提示这些基因可能为小柴胡颗粒发挥解表散热作用的关键靶点,进一步构建干酵母致热大鼠模型进行实验验证,结果显示小柴胡颗粒对干酵母致热模型大鼠发热的上升期、高峰期和下降期均有显著的降温作用,能维持体温24 h不反弹,而且其作用呈现剂量依赖性,中、高剂量的小柴胡颗粒降温能力能与阿司匹林相媲美。IL-6和TNF是目前已被证实的内生致热原,小柴胡颗粒的退热机制可能关联多个环节,如降低机体炎症水平、抑制内生致热原和抑制发热介质PGE2合成的主要限速酶环氧合酶2。

4.3 基于复方配伍环境的Q-marker预测分析 毕聪等[12]通过检索TCMSP数据库和查阅文献,筛选到167个小柴胡颗粒中的活性成分和268个潜在作用靶点,并和7味药材一起导入Cytoscape,即得到药材-成分-靶点网络图。基于退热机制和配伍规律,分析后得到7味药材共同作用的5个核心靶点,分别为NF-κB、AP-1、PTGS2、MMP9和CASP3,说明小柴胡颗粒可通过激活细胞因子、参与炎症反应、提高免疫力和直接参与退热等作用多方面地发挥退热功效。有研究[79]表明,半夏配伍生姜,生姜中姜辣素可抑制半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致的炎症因子释放、ROS的过量生成、RIP3的表达增高和巨噬细胞坏死。半夏和生姜均有降逆止呕的功效,且生姜可解半夏之毒。有研究[80]表明,黄芩与生姜配伍后,黄芩中的化学成分溶出率随着配伍比例的变化而变化,当黄芩-生姜(1∶1)配伍时对黄芩中化合物的溶出率影响最小,提示在后续对小柴胡颗粒的研究中可适当关注药材配伍变化而产生的影响。

4.4 基于成分可测性的Q-marker预测分析 刘傲雪等[81]采用一测多评法建立了同时测定小柴胡颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2和甘草酸7种化合物的含量。张雪等[4]自制小柴胡颗粒基准样品,采用UPLC法建立同时测定小柴胡颗粒中柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B1、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草苷、甘草皂苷G2和甘草酸8种成分含量的方法。王嘉林等[6]采用液相色谱电喷雾串联质谱测定小柴胡颗粒中SSa和SSd的含量,操作方法简单迅速。综合目前小柴胡颗粒中可检测的化学成分含量区间,分别为0.50%～0.77%(柴胡皂苷B1)、0.86%～2.19%(柴胡皂苷B2)、0.000 2%～0.011 0%(柴胡皂苷a)、0.000 1%～0.003 8%(柴胡皂苷d)、0.13%～49.11%(黄芩苷)、0.011%～8.80%(汉黄芩苷)、1.01%～4.32%(黄芩素)、0.001 3%～0.490 0%(汉黄芩素)、2.60%～15.42%(甘草酸)、0.001 9%～3.720 0%(甘草苷)、0.11%～1.08%(甘草皂苷G2)。在已有的对小柴胡颗粒中化学成分的检测中,发现未检出半夏、生姜、党参和大枣这4味药的特有性成分。有研究[4]表明,在含酸性溶剂的洗脱系统中SSa和SSd表现不稳定,对其检测过程中会限制流动相的选择范围;黄芩苷含量最高且稳定,对照品价廉易得;柴胡皂苷B2与市售不同厂家小柴胡颗粒的价格呈显著正向相关性,将柴胡皂苷B2纳入评价小柴胡颗粒的评价性指标,可为小柴胡颗粒的定价和优质产品提升竞争力。考虑包含主要药味的化学信息,兼顾君(柴胡)臣(黄芩)佐使(甘草)的原则,能更具有代表性和更全面地评价小柴胡颗粒的质量,可将柴胡皂苷B2、黄芩苷、黄芩素、甘草苷和甘草酸这5个化合物作为小柴胡颗粒的质量标志物。见表1和图1。

图1 小柴胡颗粒Q-marker的结构

表1 小柴胡颗粒的Q-marker信息

5 结语

中药成分复杂,单一药材中可发现的化合物多达几十种,中药材按组方原则配伍成复方制剂后成分更加繁多,因此,复方制剂在发挥治疗作用的过程中可能是由多成分之间相互产生多种模式来共同完成,而不是单一化学成分起作用,也不是多个化学成分独立作用的简单相加或堆叠。在质量评价中,更多的体现中医药特色,从不同方面反映出中药的不同属性和内涵尤为重要。在中药复方物质基础探索中,出现了越来越多的中药质量控制与评价模式,参考文献得知[82-85],已有模式如网络药理学,中药特征图谱和指纹图谱,一测多评法、聚类分析法、灰色关联分析法、直观推导式演进特征投影法和质量标志物等,这些模式从不同层面对中药质量控制与评价进行了科学分析,既有创新独特之面,又有不足之处,各种评价模式之间不能互相替代,可互补共同构成中药质量控制与评价体系。

小柴胡颗粒组方是按“君、臣、佐、使”基本结构的组方原则进行配伍而成。该方中柴胡为君药,起主要治疗作用;黄芩为臣药,辅助柴胡治疗主病、兼病或兼证,柴胡升散,黄芩降泄,此配伍构成了和解少阳的基本结构。半夏、生姜、党参和大枣四味药为佐药,佐助柴胡和黄芩以起加强治疗的作用,半夏、生姜和胃降逆止呕,党参大枣益气健脾;甘草为使药,起调和诸药的作用。此配伍方法,主和解少阳,兼补胃气,祛邪调胃,诸症自除。

基于目前可查的文献和结合现有研究,通过考察小柴胡颗粒的化学成分、药理作用、成分特有性和可测性、成分与药效的关联性以及复方配伍环境等,对小柴胡颗粒进行综合分析和最终确认,确定小柴胡颗粒的质量标志物有柴胡皂苷B2、黄芩苷、黄芩素、甘草苷和甘草酸。因本次探究是基于目前现有的研究和可查文献,结论仍值得继续探索、确证和发展。且在整理分析时发现,目前对小柴胡颗粒的研究仍有空白之处,如尚未有对佐药(半夏、生姜、党参、大枣)中特有性成分的检测,对小柴胡颗粒体内入血成分的分析及药效研究,对小柴胡颗粒不同溶剂提取物(如水提物)中化学成分及药理作用的分析研究等。相信随着药物分析现代技术的快速发展,从组方中的各味药材中发现新的更具特异性的指标性成分亦有可期,谨以此次探讨,为小柴胡颗粒以后更深入的研究提供思路和方向。