蜂王浆主蛋白研究进展

秦凯鑫,潘露霞,王子龙*

(1. 江西农业大学蜜蜂研究所,南昌 330045; 2. 江西省蜜蜂生物学与饲养重点实验室,南昌 330045)

蜂王浆是蜜蜂工蜂头部咽下腺和上颚腺分泌的淡黄色浆状物(Knecht and Kaatz, 1990)。只有蜂王和3 d内的幼虫被饲喂蜂王浆,因此,蜂王浆被认为是影响雌性蜜蜂级型分化的主要因素(Buttstedtetal., 2014)。蜂王浆中含有60%～70%水,12.5%粗蛋白,10.16%糖,3%～6%脂类,2%～3%维生素、盐和游离氨基酸等(Albertetal., 1999)。其中,王浆主蛋白是蜂王浆中水溶性蛋白,为蜂王浆中蛋白质的主要成分,占总蛋白含量的46%～89%(Schmitzovetal., 1998)。MRJPs家族一共有9个成员,依次命名为MRJP1～MRJP9。本文主要对近几年王浆主蛋白的研究进展进行综述,为今后开展相关研究提供帮助。

1 MRJPs家族鉴定

对蜂王浆中蛋白的研究始于1960年,Patel等人通过电泳分析蜂王浆中的蛋白质,其目的是为了研究幼虫食物中蛋白质与接受食物时幼虫的年龄和级型分化之间的关系,结果显示,与1～3龄幼虫相比,工蜂和雄蜂第4～6龄幼虫食物缺少水溶性蛋白质(Pateletal., 1960)。由于最初人们是通过分子量或者发现顺序对蜂王浆中蛋白质命名的,这就导致相同的蛋白质却有不同的名字(Kuboetal., 1996; Scarsellietal., 2005)。1992年,imuith等人首次发现蜂王浆中分子量为57 kDa的蛋白质,该蛋白在蜂王浆中最为丰富,被命名为“MRJP”,后被命名为MRJP1(Hanes andimuith, 1992)。MRJP2～5是通过其cDNA的克隆测序鉴定的(Klaudinyetal., 1994; Schmitzovetal., 1998; Albertetal., 1999),而MRJP6～8是通过蜜蜂脑表达序列标签(EST)文库进行同源搜索而检测到的(Albert and Klaudiny, 2004)。之后人们将蜜蜂咽下腺和毒囊进行蛋白质组学分析,发现一个蛋白水解片段,通过克隆测序证实是MRJP9(Albert and Klaudiny, 2007)。9个mrjps编码基因均在蜜蜂11号染色体上(Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006),所有mrjps以串联排列的形式位于一个大约60 kb的DNA片段上(Drapeauetal., 2006),各成员之间的核酸序列和氨基酸序列均具有较高的相似性(Helbingetal., 2017)。mrjp基因簇两侧是编码YELLOW家族蛋白的5个基因,基因组区除了 9个转录的mrjps外,中间还有1个非转录的伪基因mrjp-ψ(Drapeauetal., 2006)。

2 MRJPs家族蛋白质结构

成熟的MRJPs由400～578个氨基酸组成,其分子量在45～68 kDa之间(Buttstedtetal., 2014)。MRJP1～5富含10种必须氨基酸,且MRJP1～5是蜂王浆中最为丰富的蛋白质,占90%,说明MRJP1～5具有营养作用(Schmitzovetal., 1998)。MRJPs家族各成员N端含有信号肽序列,因此被认为是分泌蛋白(Klaudinyetal., 1994)。所有成员共享4个保守半胱氨酸残基和几个高度保守氨基酸区域,半胱氨酸残基会形成二硫键(Buttstedtetal., 2014)。MRJPs刚合成时pH值为7.0,在饲喂幼虫之前,工蜂会将其与上颚腺分泌的脂肪酸混合,使得蜂王浆pH值为4.0,MRJPs在酸性pH值中更稳定,pH值为4.0～4.5时稳定性最高(Murean and Buttstedt, 2019)。

MRJPs中具有重复区域。Su等人研究发现,MRJP2的C端具有9个五肽重复区域(Suetal., 2005)。MRJP3在编码区C端具有可变串联重复序列(VNTR)区域,该区域被认为是导致蛋白质多态性的位点(tefanetal., 1999)。MRJP5在367和540氨基酸残基之间具有广泛重复区域,重复三肽基序共出现58次,其中MRJP3和MRJP5的两个重复区域共同特征是带正电的精氨酸/赖氨酸残基和带负电的天冬氨酸残基有规律的出现(Albertetal., 1999)。由于MRJPs的重复区域中含有大量的富含氮的氨基酸,这显著增加MRJPs中氮含量,因此重复区域也被认为是生物加工形式储存氮的结构域(tefanetal., 1999)。

Klaudiny等人认为MRJP3和MRJP4存在潜在的N端糖基化和磷酸化位点,并首次提出MRJPs可能具有翻译后修饰(Klaudinyetal., 1994)。Zhang等人通过双向凝胶电泳(2-DE)、鸟枪法分析、高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱和生物信息学相结合的方法对蜂王浆的翻译后修饰进行分析,检测到MRJP1和MRJP2具有磷酸化位点,并且MRJP1～5还存在甲基化或脱酰胺化(Zhangetal., 2012)。此外,MRJP1和MRJP2都被检测出具有糖基化位点(Bílikovetal., 2009; Kimuraetal., 2010)。如今,MRJP1～9被检测出具有11～35个磷酸化和1～8个糖基化位点(Buttstedtetal., 2014)。如此多的数据证明MRJPs具有翻译后修饰,形成许多MRJP的异构体。

MRJP1的二级结构含有9.6%的α螺旋,38.3%的β折叠和20%的β转角,并且是一种高度稳定的蛋白质(Cruzetal., 2011)。Watanabe等人将MRJP1溶解于磷酸盐缓冲生理盐水中,在不同温度中加热30 min,结果表明,60℃热处理不会影响MRJP1的生长刺激活性(Watanabeetal., 1998)。但是MRJP1是一种钙调蛋白结合蛋白(Calbriaetal., 2008),钙离子会改变MRJP1构象,使其易受温度和pH值的影响(Cruzetal., 2011)。MRJP1具有独特的六叶β螺旋折叠,即MRJP1被折叠成1个六叶β螺旋桨形状,其中具有31条β链和11条α螺旋,中间还有一个通道(Tianetal., 2018)。六叶结构里有3个二硫键,其中2个二硫键的半胱氨酸残基在MRJPs家族成员中是保守的,这2个二硫键对结构稳定性至关重要(Tianetal., 2018)。MRJP1会与apisimin形成高浓度的长脂蛋白纤维结构(MRJP14-apisimin4-24-methylenecholesterol8),增加蜂王浆的粘度,使幼虫不会从王台中掉落(Buttstedtetal., 2018)。Apisimin是蜜蜂特有的一种富含丝氨酸-缬氨酸的多肽,具有形成寡聚体的倾向(Bílikovetal., 2002)。通过低温电子显微镜可以观察到这种纤维结构是由4个MRJP1组成的外壳,内部有4个apisimin,中间是8个被紧密包裹的脂质(Matteietal., 2020),分子之间通过疏水作用和氢键链接,而apisimin分子是将复合物连接在一起的关键桥梁(Tianetal., 2018)。这种纤维结构在pH值为4.0时,各单元之间静电斥力降低,使其更加稳定,而另一方面是带正电的His294与相邻的Asp292之间可能具有静电引力,因为Asp292在pH值为4.0时部分带负电荷(Matteietal., 2020)。虽然对MRJP1的二级结构有一定了解,但是MRJPs家族其他成员的二级结构研究却少之又少。

3 MRJPs在蜂产品中分布

迄今为止,许多研究者对蜜蜂的蜂王浆进行了蛋白质组学分析,所有MRJPs家族成员都能在蜂王浆中检测出来(Schmitzovetal., 1998; Sanoetal., 2004; Santosetal., 2005; Schönlebenetal., 2007)。MRJPs家族各成员在蜂王浆中含量差异非常大,其中,MRJP1～5在蜂王浆中含量较多,尤其是MRJP1,其所占比例为31%(Hanesetal., 1992)。除此之外,MRJPs也可以在其他蜂产品中检测到。Rossano等人在蜂蜜中检测到MRJP1～3相对应的多肽(Rossanoetal., 2012)。Silva等人用非靶向LC-ESI-Triple-TOF-MS/MS鉴定甘露蜜中MRJPs,通过LC-QqQ-MS/MS对蜂蜜中MRJPs标记多肽进行定量分析,结果表明,MRJP4中标记肽(QNIDVVAR)的含量可以作为区分甘露蜜和花蜜的指标(Silvaetal., 2020)。MRJP1和MRJP2也在蜜蜂粉脾中被检测到(Scarsellietal., 2005)。MRJP8和MRJP9在蜜蜂毒液和假定的过敏原中被鉴定出来(Blanketal., 2012)。因此,不论是蜂王浆还是其他蜂产品都可以检测到MRJPs。

4 mrjps家族的表达

4.1 mrjps在蜜蜂体内的表达

mrjps在蜜蜂多个组织中均有表达。Dobritzsch等人通过qRT-PCR和定量质谱分析发现,工蜂咽下腺和大脑中mrjp1～5和mrjp7的表达具有年龄依赖性,即mrjps的表达在哺育蜂时期上调,而在采集蜂时期下调,并且咽下腺中的相对丰度高于大脑(Dobritzschetal., 2019)。哺育蜂的任务是饲喂幼虫,其咽下腺mrjps表达显著高于采集蜂,从侧面证明MRJPs具有营养功能(Fengetal., 2009)。但是蜜蜂咽下腺细胞具有灵活性,随着日龄增加,蜜蜂将不再哺育而是出门采集花粉、蜜和树脂等,若蜂群需要,采集蜂将重新激活腺泡,合成与分泌MRJPs,哺育幼虫(Ohashietal., 2000)。不仅仅是工蜂,mrjps在蜂王和雄蜂的头部、胸部和腹部都有表达,其中mrjp1～7在工蜂头部表达更为显著(Buttstedtetal., 2013)。李晓燕等人研究表明mrjp6在蜜蜂幼虫和蛹期时表达量较低,而三型蜂中,蜂王与工蜂的表达量显著高于雄蜂(李晓燕等,2016)。李江红等人发现mrjp8在工蜂毒腺组织内表达量高,而雄蜂体内表达量最低,这可能暗示mrjp8与工蜂防御有关(李江红等,2014)。有趣的是,mrjp9表达与其他的mrjps不同,其在蜂王和工蜂的头部、胸部、腹部表达都很高,因此MRJP9被认为是最古老的王浆主蛋白(Buttstedsetal., 2013)。

4.2 外界因素对mrjps表达的影响

mrjps及蛋白质的表达会受到外界因素影响。在食物中添加20-羟基蜕皮酮(20E)后,蜜蜂中mrjp1～3表达下调,其中mrjp3表达量最低(Winkleretal., 2018)。Fent等人将蜜蜂暴露不同的杀虫剂中,结果显示毒死蜱会使采集蜂大脑中mrjp2和mrjp3表达下调,吡虫啉会使采集蜂大脑中mrjp1表达下调(Fentetal., 2020)。Scharlaken等人研究表明,蜜蜂在感染大肠杆菌8 h之后,mrjp3在头部的表达上调,而mrjp4表达下调(Scharlakenetal., 2007)。蜜蜂幼虫在感染类芽孢杆菌后,mrjp1～3在蜜蜂血淋巴中的表达下调(Chanetal., 2009)。多菌灵是一种杀菌剂,在多菌灵的刺激下,蜜蜂头部中mrjp1～7和9的表达会下调(Wangetal., 2021)。因此,mrjps及蛋白质的表达受激素、杀虫剂和细菌的影响。

5 mrjps在其他膜翅目昆虫中同源体

除了蜜蜂之外,mrjps在其他膜翅目中也存在同源体。在寄生蜂Nasoniavitripennis中鉴定出10个与蜜蜂mrjps类似的基因,分子证据表明,这两组基因拥有一个共同祖先(Werrenetal., 2010)。Sumner等人研究表明,mrjps在群居型黄蜂Polistescanadensis的蜂王中表达(Sumneretal., 2015)。Tian等人的研究发现,膜翅目蚁科的火蚁也会表达mrjps,并且认为这与蚁后交配或繁殖行为有关(Tianetal., 2004)。在阿根廷蚂蚁Linepithemahumile中也鉴定出10个yellow和10个mrjps(Smithetal., 2011)。或许mrjps在其他膜翅目昆虫中具有重要的作用。

6 mrjps家族进化

最初,Albert等人只鉴定出5种王浆主蛋白,即MRJP1～5,并且发现MRJPs与果蝇的YELLOW有着共同的进化起源,MRJPs家族的分化可能导致该基因家族有新功能(Albertetal., 1999)。Drapeau等人不仅证实了Albert等人的研究,还认为mrjp家族是由yellow-e3进化而来(Drapeauetal., 2006)。Drapeau等人将内含子/外显子结构进行对比,发现mrjps与yellow-e3内含子/外显子结构高度相似,通过微阵列表达数据得出yellow-e3与mrjp功能上有共同之处(Drapeauetal., 2006)。Buttstedt等人认为mrjp9是mrjps中的始祖基因,蜜蜂高拷贝数是由一个古老基因复制而导致的,mrjp9在蜂王和工蜂的头部、胸部、腹部表达都很高,并且一些只分泌1种MRJP的物种(如熊蜂Bombusterrestris等)的mrjp与mrjp9相似度最高,因此mrjp9被认为是最古老的基因(Buttstedtetal., 2013)。Kupke等人认为熊蜂是一个过渡物种,熊蜂的王浆主蛋白称为BtRJPL(B.terrestrisroyal jelly protein-like),将熊蜂BtRJPL基因簇与西方蜜蜂apismelliferamrjps的对比显示,除了yellow-e3和yellow-h之间只有一个BtRJPL基因外,其基因排列顺序相同,并且发现BtRJPL参与食物的消化(Kupkeetal., 2012)。寄生蜂中5个mrjps串联排列在3号染色体上,两侧是yellow,在染色体远端还有1个mrjp,另外3个mrjps在4号染色体上,最后1个在Scaffold 1011上(Buttstedtetal., 2014)。寄生蜂是迄今为止在昆虫中发现mrjps数量最多的,与蜜蜂mrjps具有一个共同起源(Werrenetal., 2010)。阿根廷蚂蚁具有10个yellow和10个mrjps,其中8个yellow与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的相似,可能为同源基因(Smithetal., 2011)。类似于西方蜜蜂和寄生蜂,阿根廷蚂蚁基因组中mrjps独立聚类为一类,这表明祖先基因在分化过程中可能出现复制,使mrjps有新的功能(Johnson and Linksvayer, 2010; Smithetal., 2011)。

7 MRJPs家族功能

MRJP1及其酶解产物具有多种生物学活性,其中最重要的功能是营养功能。Kamakura研究表明,MRJP1单体(称为royalactin)在延长蜂王寿命中发挥重要作用,并且能诱导幼虫分化为蜂王,是影响蜂王和工蜂级型分化的主要物质(Kamakura, 2011)。然而,Buttstedt等人反驳了这个观点,他们认为决定级型分化的主要因素是摄入的食物量,充足的摄入量会给幼虫提供更多更均衡的营养物质,而不是单一的化合物,MRJP1为蜂王幼虫提供必须营养物质(Buttstedtetal., 2016)。

MRJP1对人类骨髓细胞有生长刺激作用(Watanabeetal., 1998)并且MRJP1单体与apisimin所组成的低聚物具有促进细胞增殖作用(Tamuraetal., 2009)。Kamakura等人通过研究表明MRJP1可以刺激原代培养的大鼠肝细胞DNA的合成,从而促进肝细胞的增殖,在这一过程中MRJP1起着有丝分裂原的作用,而且这种刺激作用呈剂量依赖性(Kamakuraetal., 2001)。MRJP1还具有杀菌作用,Vezeteu等人研究发现MRJP1不仅可以抑制欧洲幼虫腐臭病细菌生长,还能抑制其病原菌生长(Vezeteuetal., 2016)。Brudzynski等人通过半定量径向扩散法和微量液稀释法来评估多重耐药菌对glps(一种包含MRJP1的糖蛋白)的敏感性,结果表明glps具有快速杀菌活性(Brudzynskietal., 2015)。Fan等人通过蛋白质组学分析发现,MRJP1显著降低血管平滑肌细胞收缩、迁移和增殖,表明MRJP1具有降血压作用(Fanetal., 2016)。胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解MRJP1后得到11个血管紧张素I型转化酶抑制肽,可有效地抑制人体血管紧缩素Ⅰ型转化酶的活性(Matsuietal., 2002)。

低密度脂蛋白(LDL)与氧化修饰的低密度脂蛋白(Ox-LDL)是动脉粥样硬化病的主要成分,王浆素(Royalisin)和MRJP1、MRJP3的降解产物能与LDL和Ox-LDL结合,从而抑制巨噬细胞增值,减少斑块信息,有助于治疗动脉粥样硬化(Satoetal., 2021)。Okamoto等人研究表明,MRJP3可以抑制小鼠T细胞产生IL-4(白细胞介素-4)、IL-2(白细胞介素-2)和IFN-γ,具有抗过敏作用(Okamotoetal., 2003)。Maori等人发现,MRJP3是一种分泌的非序列特异性RNA结合蛋白,可以与多价RNA结合,使其转变为eRNP颗粒,该颗粒可以浓缩、保护、增强RNA的摄取,促进RNA转移(Maorietal., 2019)。MRJP3具有细胞增殖和伤口愈合的作用,Minegaki等人证明MRJP3羧基端串联五肽重复序列能促进细胞增殖(Minegakietal., 2020)。

MRJP4对细菌、真菌和酵母具有广泛的抗菌作用(Kimetal., 2019)。蜂毒中含有MRJP8和MRJP9(Blanketal., 2012),Kim发现蜂毒处理哺乳动物细胞后会引起炎症反应,而MRJP8可以调节细胞H2O2和促炎症分子的产生,保护细胞,并且蜂毒中的MRJP8可以降低caspase-3的活性,具有抗凋亡作用(Kim, 2021)。

8 总结与展望

到目前为止,人们对MRJPs家族进行了大量研究。从蜂王浆中蛋白质的鉴定、MRJPs的表达与合成、mrjps家族进化,到MRJPs的结构与功能,如此多的研究数据让科研人员不断地深入了解MRJPs家族,但是仍然有许多地方不清楚。级型分化机制研究对于社会性昆虫至关重要,MRJP1能影响蜜蜂的级型分化,但是其中的机理仍一无所知,这或许是今后的研究方向。mrjps存在于其他膜翅目昆虫中,但是其功能我们还是不太了解。或许,在揭示mrjps功能时,不应该仅限于蜜蜂。