利用毕赤酵母底盘产生大麻二酚酸合成酶及其催化活性分析

牛庭莉，田 媛，张利国，张树权，李志江，康 悦，迟 建，高宝昌,，戴凌燕,

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江省科学院大庆分院植物化学研究所，黑龙江大庆 163316；3.黑龙江省农业科学院经济作物研究所，黑龙江哈尔滨 150086；4.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

大麻是一年生麻科草本植物，被称为大麻或汉麻，在世界各地种植已有数千年，主要应用在医药、化工和食品领域[1-2]。天然产物大麻素是大麻植物产生的独特次级代谢物，主要存在于大麻的毛状体油室中，是由聚酮和单萜亚结构组成。目前为止，已分离出100 多种大麻素[3]。其中，酸性大麻素四氢大麻酚酸（THCA）、大麻二酚酸（CBDA）和大麻环萜酚酸（CBCA）含量最丰富，且三者均以CBGA 为底物经酶催化而成。其他类型大麻素大多是由这三种物质在热和光照下通过非酶转化、降解反应和自氧化等方式获得[4-5]。在这些代谢物中，具有精神活性的Δ9-四氢大麻酚（THC）[6]，由于具有潜在的治疗价值，包括镇痛、抗惊厥、止吐和开胃性而备受关注[7-8]。大麻二酚（CBD）是一种与THC 具有不同环状结构的同分异构体，近年来在治疗阿尔兹海默病、帕金森病、癫痫，以及抗肿瘤和神经保护等方面发挥着重要作用[9-11]。此外，CBD 在食品和化妆品上的应用也比较广泛。CBD 油可缓解焦虑，CBD 糖浆可以安神和缓解疼痛，CBD 苏打水可以舒缓痛症和调节亚健康问题；还有加入适量CBD 的饼干、巧克力、啤酒、披萨等食品，具有独特香气，让人身心愉悦[12]；含有CBD 的化妆品具有舒缓皮肤敏感，抗炎及治疗粉刺等作用[13]。但目前CBD 原料短缺、价格高昂、生物提取得率低等问题，限制了其产业发展和应用领域拓展。

酵母表达系统在上个世纪70 年代被发现，在2006 年经美国FDA 批准，获得“最安全微生物”称号[14-15]。毕赤酵母（Pichia pastoris）是在甲醇培养基中生长的一种甲基营养菌，可利用AOX1 启动子来驱动外源蛋白的高水平表达[16-17]。酵母异源表达系统有许多优点，发酵培养基取材稳定、成本低廉、繁殖快速；与细菌相比，具有翻译后修饰，易于遗传操作等优势[18]。外源目的基因线性化后，利用同源重组方式可将外源基因高效整合到酵母细胞的染色体中，产生稳定的细胞系[19-23]。

大麻二酚酸合成酶（CBDAS）可催化底物CBGA生成CBDA，而CBDA 在高温下易脱羧形成CBD。以大麻花叶为材料生物提取大麻素的粗提液中含有很多组分，其中还有一定含量的CBGA 未被完全转化。若能利用操作简便，经济高效的方法获得CBDAS，便可通过体外反应将粗提液中残存的CBGA 进一步单一转化成CBD。本研究以高含量CBD 品种为材料，采用PCR 克隆技术获得CBDAS基因，并构建酵母表达载体，在毕赤酵母中重组表达，利用高效液相色谱分析CBDAS 合成酶的催化活性。研究结果可为工业化定向提高CBD 生物提取率奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大麻材料 由黑龙江省农业科学院经济作物所提供；毕赤酵母GS115 和大肠杆菌DH5α感受态购自昂羽生物技术（上海）有限公司；pPIC9K-His 载体 购自淼灵生物技术（武汉）有限公司；GreenGate克隆载体C000 本实验室保存；植物DNA 提取试剂盒 天根生化科技（北京）公司；质粒提取试剂盒索莱宝科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒 Omega（美国）公司；限制性内切酶EcoRI、NotI、SacI 和PstI NEB（美国）公司；高保真酶Phanta Super-Fidenlity DNA Polymerase 诺唯赞生物科技（南京）有限公司；ThunderbirdTM SYBR® qPCR Mix TOYOBO（日本）公司。

5428 高速冷冻离心机 德国艾本德公司；Veriti96梯度PCR 扩增仪 美国赛默飞公司；HB-96D 恒温槽 韩国WiseTherm 公司；HV-50 高压蒸汽灭菌器 日本Hirayama 公司；V-1300 可见光分光光度计 上海美析仪器公司；NS-100B 恒温振荡摇床 杭州川恒实验仪器公司；CFX96 实时荧光定量PCR 仪 美国伯乐公司；1260 高效液相色谱仪 美国安捷伦。

1.2 实验方法

1.2.1 大麻基因组提取 称取适量高CBD 含量的大麻叶片经液氮研磨后，按照植物DNA 提取试剂盒说明书提取总基因组。使用NanoDrop2000 检测DNA 浓度和质量。DNA 保存在-20 ℃备用。

1.2.2CBDAS基因的克隆 使用Primer3 plus（https://www.primer3plus.com/）在线网站设计特异引物。以大麻基因组DNA 为模板进行PCR 扩增。本实验选用高保真聚合酶进行目的片段的扩增，PCR 扩增程序：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32 个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶，按照胶回收试剂盒说明书进行纯化。将纯化产物与C000 载体连接生成C000-CBDAS 载体，转化DH5α感受态后选取阳性克隆进行测序。引物合成和测序均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息学分析 使用Snapgene 软件将测序后的CBDAS基因序列翻译成氨基酸，利用在线软件Expasy（https://www.expasy.org/）中的ProtParam-和ProtScale 分析CBDAS 蛋白的基本理化性质和亲/疏水性，利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.-de/）和NCBI 的CD-search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）在线软件分析CBDAS 蛋白的保守结构域，利用NetNGlyc-1.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）在线软件分析CBDAS蛋白的糖基化位点。

1.2.4 酵母表达载体的构建 设计含有NotI 和EcoRI酶切位点的特异性引物ppCBDAs-F 和ppCBDAs-R，保护碱基和酶切位点用下划线表示（见表1）。以C000-CBDAS 质粒为模板，用带接头引物进行PCR扩增，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收。使用NotI 和EcoRI 酶分别对回收产物和pPIC9K载体进行双酶切，纯化后连接成pPIC9K-CBDAS 质粒，并转化大肠杆菌，通过测序和酶切鉴定筛选阳性克隆。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 酵母转化和阳性重组菌的筛选 将重组质粒pPIC9K-CBDAS 经SacI 限制性内切酶进行线性化，再通过电转化方式导入毕赤酵母GS115 感受态中；将细胞液均匀涂布于MD 固体培养基上，于30 ℃倒置培养3～5 d。参考赵明明等[24]方法，用去离子水冲洗平板上的菌落并收集，吸取200 μL 菌液涂布于不同G418 浓度（1、2、4、6 mg/mL）的YPD 平板上，于30 ℃倒置培养3～5 d。挑取YPD 平板上的单克隆，采用高温-乙酸乙酯法提取酵母基因组[25]；以AOX1-F 和CBDAS-R 为引物进行PCR 鉴定。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 15 s，32 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.6 重组蛋白的诱导表达 参考卢可心[26]方法，挑取鉴定为阳性的重组菌接种至YPD 液体培养基，于30 ℃、190 r/min过夜培养；将活化的菌液按1%接种于20 mL BMGY 培养基，于30 ℃、190 r/min培养至OD600为2～6 时，利用血球计数板计算酵母菌数量，收集菌体后用BMMY 培养基重悬至菌数约为8.0×109个/mL，再于30 ℃、190 r/min 培养，每隔24 h 补充1%体积比的甲醇，连续诱导96 h。每组3 个重复，取菌体破碎后进行SDS-PAGE 分析。

1.2.7 Western blot 分析 将pPIC9K-CBDAS 重组蛋白通过SDS-PAGE 电泳分离后转移至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h 后，用TBST 冲洗表面。将PVDF 膜转至含有His 抗体（1:5000）的TBST中，4 ℃孵育过夜。TBST 摇晃清洗6 次（5 min/次）后移至含有HRP 标记的二抗TBST 中（1:4000），室温孵育2 h，TBST 摇晃清洗6 次（5 min/次）。最后用ECL 超敏化学发光检测试剂盒和成像分析仪检测条带。

1.2.8 荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达情况

培养方法同1.2.6，在诱导48 h 后收集酵母菌，用Trizol 法提取总RNA，核酸蛋白测定仪检测RNA 浓度及纯度，符合A260/A280=1.8～2.1 后用于逆转录反应。使用逆转录试剂盒合成cDNA，反应体系10 μL，反应条件：37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min；4 ℃，保存。采用SYBR® Green Realtime PCR MasterMix 进行qRT-PCR 反应，反应体系20 μL，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，共39 个循环，引物序列见表1。反应完成后，确认扩增曲线及融解曲线，导出ct 值，以毕赤酵母菌的Actin基因为内参，相对定量用2-∆Ct来分析基因的表达水平[27]。

1.2.9 重组蛋白诱导表达的条件筛选 选取可以成功表达的重组菌株进行后续筛选，诱导时间为0、12、24、48、72、96 h；诱导培养基BMMY 的pH 分别为3.0、4.5、6.0、6.5、7.0、7.5；甲醇添加量为0.5%、0.75%、1%、2%、4%，为保证甲醇浓度不变，每隔24 h 再次添加；具体操作同1.2.6，每组三个重复。

1.2.10 CBDAS 酶活性测定

1.2.10.1 大麻萜酚酸（CBGA）的提取 取高CBGA含量大麻品种的烘干叶片，每0.1 g 中加入50 mL 甲醇，超声破碎30 min 后，4 ℃离心20 min 收集上清液，再用0.22 μm 滤膜去除杂质，-20 ℃保存备用。

1.2.10.2 反应液的制备 反应体系参照修改的Taura等[28]方法，体系一中加入100 μL CBGA 粗提液，0.5 μL TritionX-100，超滤浓缩后的重组蛋白液25 μg，用0.1 mol/L 柠檬酸钠缓冲液（pH5.0）定容至500 μL。在37 ℃反应0、2、4、8、12 h 后，加入600 μL甲醇终止反应，每组三次重复；将反应液离心3 min，取上清，过0.22 μm 滤膜，用于HPLC 检测；体系二中将CBGA 粗提液换成终浓度为25 μmol/L CBGA标准品，在37 ℃反应12 h 后，加入600 μL 甲醇终止反应，其余成分和反应过程均和体系一相同。通过产生CBDA 和CBD 的含量来反映酶的生物活性。

1.2.10.3 液相色谱条件 色谱柱：Shimadzu sil-16 C18柱（150 mm×4.6 mm×3 μm），柱温：30 ℃；流动相：A 为水溶液中含有0.1%甲酸，B 为乙腈中含有0.1%甲酸；等度洗脱：25% A，75% B，保留时间30 min；紫外检测器：230 nm；流速：0.7 mL/min；进样量：10 μL。

1.3 数据处理

DNA 序列和氨基酸序列数据用Snapgene 软件处理。使用统计学软件SPSS23.0 和Prism 5.0 进行分析作图，采用单因素方差分析比较各组间数据，t检验法进行组间差异显著性分析，P<0.05 差异显著。

2 结果与分析

2.1 CBDAS 基因的克隆

以大麻的基因组为模板，使用引物CBDASF 和CBDAS-R 进行PCR 扩增，电泳图如图1。通过测序可知CBDAS基因全长1635 bp，编码544 个氨基酸，Taura 等[28]在克隆纤维型大麻CBDAS基因时，也得出该基因编码544 个氨基酸的结论。将克隆的CBDAS基因序列信息提交到NCBI 数据库（登录号OP627908），但与NCBI 数据库已公布大麻CBDAS基因序列（登录号NC_044378.1）比较，有6 处碱基不同，引起2 个氨基酸发生改变（Cys-Tyr和Lys-Gln），其余4 个为同义突变（图2）。可见，不同大麻品种间CBDAS基因存在差异。

图1 CBDAS 基因扩增结果Fig.1 Amplification results of CBDAS gene

图2 CBDAS 基因序列比对Fig.2 Alignments of CBDAS gene sequences

2.2 CBDAS 蛋白的生物信息学分析

利用在线分析软件ProtParam 预测了大麻CBDAS蛋白的基本理化性质。结果表明，CBDAS 蛋白分子量为62.3 kD，理论等电点pI 为8.84；具有51 个酸性氨基酸残基（Asp+Glu），59 个碱性氨基酸残基（Arg+Lys）；分子式为C2843H4351N745O793S20；在酵母中估算的半衰期大于20 h。此外，CBDAS 蛋白的不稳定系数为29.28（小于40 属于稳定蛋白），亲水性平均系数（Grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.219，因此，CBDAS 是稳定的亲水性蛋白。常丽等[29]利用ProtPScale 软件预测大麻品种Carmen的CBDAS 蛋白时，得出其不稳定系数为30.57，GRAVY 为-0.202，与本研究的结论相似。利用NetNGlyc-1.0 在线软件分析发现CBDAS 蛋白存在7 个N-糖基化位点，分别是位于45、65、168、296、304、328、498 位的天冬酰胺。利用Smart 和NCBI的CD-search 软件分析CBDAS 蛋白的保守结构域，两者结果一致（图3），氨基酸479-537 范围的结构域为BBE，存在于小檗碱桥和小檗碱桥样酶中，这些酶参与许多异喹啉生物碱的生物合成；而81-218 结构域家族由多种利用FAD 作为辅助因子的酶组成，大多数酶类似于氧化还原酶。

图3 CBDAS 蛋白的保守结构域分析Fig.3 Analysis of conservative domains of CBDAS protein

2.3 重组酵母表达载体构建与鉴定

以C000-CBDAS 为模板，以ppCBDAS-F/R 为引物，扩增获得的CBDAS基因片段大小约为1635 bp。CBDAS基因回收产物与酵母表达载体pPIC9K 用EcoRI 和NotI 分别进行双酶切，经回收、连接、转化后进行鉴定。用AOX-F 引物对载体进行测序，比对后表明序列正确。再用SacI 限制性内切酶对测序正确的重组子进行线性化，再用PstI 酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，可见5297、2555、1827 和1241 bp等不同片段（图4）。测序和酶切验证后表明，重组酵母表达载体pPIC9K-CBDAS 构建成功。

图4 重组酵母表达载体pPIC9K-CBDAS 的酶切鉴定Fig.4 Enzymatic digestion identification of recombinant yeast expression vector pPIC9K-CBDAS

2.4 毕赤酵母转化和阳性重组菌筛选

将线性化质粒电转入毕赤酵母GS115 感受态中，30 ℃培养3～5 d，再利用不同浓度G418 筛选高拷贝菌后，挑取单菌落提取基因组DNA，用pPIC9K载体中AOX1 和CBDAS基因序列设计的引物进行PCR 扩增，获得2002 bp 的条带（图5），表明pPIC9KCBDAS 质粒已经整合到毕赤酵母GS115 的染色体中。

图5 重组酵母菌株PCR 鉴定Fig.5 PCR identification of the recombinant yeast

2.5 Western blot 和qRT-PCR 验证重组蛋白表达

以酵母菌的Actin基因为内参，经qRT-PCR 分析后发现，在以水为阴性对照（CK）和转入空载体pPIC9K 的酵母菌中，均未检测到CBDAS基因的表达，而在重组菌中有该基因的表达（图6A）。Western blot 分析显示，重组蛋白CBDAS 在毕赤酵母中能正常表达，在75 kD 处具有特异性条带，而在导入空载体酵母菌中无表达（图6B），比利用Protparam 软件预测的蛋白分子质量（62.3 kD）略大，在前面糖基化位点分析时发现CBDAS 蛋白存在多个N-糖基化位点，推测该酶在酵母表达中可能发生糖基化修饰而导致分子量变大。姚昌阳等[30]也在利用毕赤酵母诱导表达裂解多糖单加氧酶（LPMO）的研究中发现，重组的LPMO 蛋白条带大小范围为46～50 kD，比预测的分子量34 kD 大，认为该蛋白发生了糖基化修饰。

图6 qRT-PCR 基因表达分析和重组蛋白的Western blot 验证Fig.6 Gene expression analysis by qRT-PCR and Western blot validation of the recombinant protein

2.6 重组CBDAS 蛋白诱导表达的条件筛选

pPIC9K 为分泌型载体，理论上应会在胞外分泌出大量重组蛋白。但可能由于多肽链在内质网中聚集，导致加工以及囊泡运输等过程影响外源蛋白分泌表达，从而使一定量外源蛋白仍滞留在胞内[31]。由于上清中CBDAS 蛋白较少所以收集菌体经超声破碎后的蛋白用于后续实验。为使重组CBDAS 蛋白高效表达，对主要影响其表达的诱导时间、甲醇浓度和诱导培养基BMMY 的pH 等因素进行筛选，结果如图7。诱导时间、甲醇浓度和培养基的pH 对重组蛋白表达确有较大影响，重组菌在培养48 h，诱导培养基pH6.0，1%甲醇添加量时表达量最大。

图7 重组蛋白诱导表达的条件筛选Fig.7 Screening conditions for inducing expression of recombinant protein

2.7 CBDAS 酶活性分析

将转入空载体pPIC9K 酵母菌株和导入目的基因的重组酵母菌株pPIC9K-CBDAS 同时在诱导培养基BMMY（pH6.0），1%甲醇添加量下进行诱导培养，48 h 后收集菌体经超声破碎收集上清液，用超滤管进行浓缩制备成待测酶液，利用BCA 试剂盒检测总蛋白浓度，毕赤酵母重组酶活性测定如图8。反应体系的总体积保持不变，设置一组只加底物不加酶液的空白对照（CK），另两组分别加入pPIC9K 和pPIC9K-CBDAS 重组菌株提取的酶液。当使用大麻叶片粗提液中CBGA 为底物发生反应时，由于粗提液中含有CBDA 和CBD，因此，在0 h 时三组均会检测到这两种物质。随着反应时间增加（0～12 h），CK 组和pPIC9K 组的CBDA 和CBD 的含量略微下降，但差异不显著。对于pPIC9K-CBDAS 组来说，反应2 h 后，CBDA 和CBD 的含量未发生显著变化；当反应4 h 后，CBDA 含量显著增加（P<0.05）；在8h 后CBD 含量显著增加（P<0.05），12 h 时生成的CBDA 和CBD 含量达到最大值；在重组酶CBDAS作用下，新合成CBDA 60.64 ng/mL，CBD 128.01 ng/mL，分别比pPIC9K 组的高15.67 倍和37.87 倍（图8A～图8E）。为进一步确定重组CBDAS 的生物活性，减少大麻叶片粗提液中其他物质对反应的干扰，以CBGA 标准品为底物，反应12 h 后分析重组酶催化底物CBGA 产生CBDA 和CBD 的情况，结果如图8F。CK 组和pPIC9K 组中未检测到CBDA，但有CBD 检出，这是因为CBGA 标准品中含有少量的CBD 而导致；pPIC9K-CBDAS 组中新合成CBDA 20.12 ng/mL，CBD 207.87 ng/mL，CBD 含量比pPIC9K组高9.34 倍。CBDAS 酶和底物发生反应直接生成CBDA，但当反应时间长于4 h 后，CBDA就会发生脱羧反应生成CBD，所以在8 和12 h 时会产生大量的CBD。由上可知，通过毕赤酵母重组产生大麻的CBDAS 无论在大麻叶片粗提液还是标准品中，都可以催化底物CBGA 生成CBDA 和CBD。经对比，以CBGA 标准品为底物的转化效率明显低于大麻叶片粗提液，这可能由于在CBGA粗提液中含有的复杂物质成分所致，可促进CBDAS酶催化活性，并增强CBDA 脱羧作用。

图8 重组酶催化底物CBGA 产生CBDA 和CBD 的情况Fig.8 Production of CBDA and CBD by catalyzing substrate CBGA by the recombinant enzyme

3 结论

大麻品种间CBDAS基因存在差异，从而使蛋白的基本理化性质发生改变，本研究中克隆得到CBDAS经生信预测认为是一种稳定的亲水性蛋白。目前，人们多以大麻花叶为材料来提取大麻素，存在季节依赖、周期长、纯度低等问题，且在提取CBD 过程中会浪费粗提液中尚存的CBGA。利用经济高效的方法获得CBDAS，便可通过体外反应将粗提液中残存的CBGA 进一步转化成CBD。本文通过构建酵母表达载体，转化毕赤酵母获得重组菌，经qTRPCR 和Western blot 验证后认为CBDAS基因可在酵母中得到表达。而重组菌在培养48 h、培养基pH6.0 和1%甲醇添加量等诱导条件下CBDAS 蛋白表达量最大。通过毕赤酵母重组产生大麻的CBDAS无论在大麻叶片粗提液还是标准品中，都可以催化底物CBGA 生成CBDA 和CBD，具有很强的生物活性。研究结果为今后CBD 在医疗、食品和化妆品等领域的应用开发提供基础。重组CBDAS合成酶在大麻叶片粗提液中的催化活性高于CBGA标准品，其具体原因还有待于进一步研究。