基于生物信息学分析miR-629-3p在头颈部肿瘤发生中的作用

杨 军 隋承光 李 妍 孟凡东

【提 要】 目的 探讨微小RNA(miRNA-629-3p)在头颈部鳞状细胞癌中的表达及其相关临床意义。方法 通过TCGA数据库数据进行生物信息学方法分析,获得在头颈部肿瘤中表达的微小RNA,选取高表达的miR-629-3p;K-M plot观察miR-629-3p对患者生存的影响;TIMER2.0分析与免疫浸润的相关性;Western blot法检测相关蛋白的表达采用水平。结果 miRNA-629-3p在头颈部肿瘤患者中高表达; miR-629-3p作为预测生存预后的一个指标具有较高的敏感度和特异度;免疫浸润分析得出,T、B及NK细胞参与了头颈部肿瘤的浸润,且与miR-629-3p的表达具有明显的相关性;沉默miRNA-629-3p后,Wnt、β-catenin和Survivin的表达水平明显降低,而E-cadherin的表达水平明显升高。结论 头颈部肿瘤患者的miRNA-629-3p表达水平上调,可能在恶性转化过程中起到重要作用,有望成为评估头颈部肿瘤患者病情的有效指标。

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous-cell carcinoma,HNSC)是目前最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的健康,主要累及头颈部不同的组织和器官[1]。HNSC的临床治疗方案主要根据肿瘤的TNM分期制定。综合治疗以手术、放疗、化疗[2]及免疫治疗为主[3]。HNSC的治疗虽然取得了一定进展,但5年生存率并没有显著提高[4]。因此,早期诊断、准确的预后评估和进一步的有效治疗是非常必要的。为改善疾病预后,全面了解肿瘤的发病机制,及时寻找可靠的肿瘤标志物提高HNSC患者的治疗效果,制定有效的治疗方案具有重要的临床意义。

微小RNA(microRNA,miR)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA,其数量仅占整个基因组的l%,主要在转录后水平调控基因的表达。miR-629-3p是一种促癌因子,已经被报道参与乳腺癌、肺腺癌和喉癌等恶性发展过程[5-6]。最新研究发现,miR-629-3p能够被环状DNAcircNRIP1海绵吸附,通过PTP4A1/ERK1/2信号通路影响宫颈癌细胞的侵袭[7]。Zhang等[8]发现miR-629-3p在胶质细胞源性神经营养因子处理的U251细胞中表达异常上调。

随着对microRNA研究的不断深入,实验证据显示其在细胞的发育、分化、迁移、凋亡等方面均发挥重要作用。目前尚无miR-629-3p在头颈部肿瘤中的相关研究,为此,本研究通过生信分析头颈部肿瘤患者组织中miR-629-3p的表达情况及相关临床意义,为进一步研发临床治疗方案提供一定的参考依据。

资料与方法

1.资料获取

通过生物信息学网站The Cancer Genome Atlas(TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库,筛选头颈部肿瘤中高表达的microRNA,获取患者的相关临床资料,通过K-M plot对头颈部肿瘤患者进行生存分析,GSEA(http://www.gsea-msigdb.org/)进行聚类分析,TIMER2.0数据库获得免疫浸润的相关信息,Starbase数据库预测与microRNA表达相关的信号通路。

2.材料

喉癌细胞株(TU212)购自上海细胞库。所用试剂:DMEM培养基(Gibco),胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),PBS缓冲液(普诺赛)。Wnt抗体(abcam),Survivin抗体(abcam),E-cadherin抗体(abcam),β-catenin抗体(abcam),山羊抗兔二抗(abcam)等。

3.细胞培养

复苏的TU212细胞加入含有10% FBS的DMEM培养液制备成细胞悬液,接种于培养瓶中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养,每隔3天更换一次新鲜的培养液。

4.miR-629-3p瞬时转染

取对数生长期的TU212细胞,PBS洗1次,胰酶消化,制成细胞悬液接种于6孔板中,当细胞长至60%时更换为无双抗的培养基继续培养,使用 miR-629-3p inhibitor干扰内源性miR-629-3p的表达,inhibitor NC作为阴性对照组,每孔的转染量为50pmoi,48h后提取总蛋白,用于后续Western blot实验。

5.Western blot法

为进一步验证miR-629-3p在头颈部肿瘤中的作用,按照蛋白提取试剂盒说明书提取TU212细胞的总蛋白,电泳(上胶85v,下胶125v),转膜(90mA,90min),洗膜,5% BSA封闭1h,一抗4℃过夜孵育,洗膜,二抗室温摇床孵育1h,洗膜,发光。Image J软件分析灰度值。

6.统计学分析

采用SPSS 22.0中的单因素方差分析,比较各组之间的差异。R包:主要采用ggplot2用于相关临床数据分析,及可视化分析;survival包用于生存资料的统计分析;pROC包用于绘制ROC曲线。P<0.05视为差异有统计学差异。

结 果

1.microRNA的筛选

通过TCGA数据库筛选头颈部肿瘤中高表达的microRNA,设定条件:P<0.01,∣lgFC∣≥2,获得结果为:miR-629-3p在头颈部肿瘤中高表达(图1)。

图1 差异表达的火山图

2.miR-629-3p在头颈部肿瘤中的表达

通过TCGA数据库获得miR-629-3p在头颈部肿瘤中的表达水平,结果显示miR-629-3p在头颈部肿瘤组织中高表达,与正常组织相比(P<0.01),差异具有统计学意义(图2,A:配对样本的差异分析;B:非配对样本的差异分析)。

图2 miR-629-3p的表达水平

3.miR-629-3p对头颈部肿瘤的生存影响

miR-629-3p对头颈部肿瘤患者生存的影响通过K-M plot数据库得出,Nomogram列线图显示,5年的生存概率明显低于1年和3年的生存概率;ROC曲线图结果提示miR-629-3p对于生存率的预测具有一定的准确性(图3,A:预后列线图;B:ROC曲线)。

图3 miR-629-3p对生存的影响

4.miR-629-3p的临床意义及与免疫浸润的相关性

从TCGA数据库获得头颈部肿瘤患者的相关临床资料,通过分析miR-629-3p与临床患者TNM分期的相关性,得出miR-629-3p与头颈部肿瘤患者的M期具有显著的相关性(P=0.03),与N分期有一定的相关性(P=0.05),与T分期及年龄无明显相关性(P>0.05)(图4A)。

图4 miR-629-3p的临床意义

免疫细胞在很大程度上参与了肿瘤细胞的浸润,TIMER2.0得出如图4B所示结果,头颈部肿瘤中miR-629-3p的表达与T细胞、B细胞呈明显的正相关,与NK细胞呈负相关,得出T、B及NK细胞的表达会影响头颈部肿瘤患者miR-629-3p的浸润水平。

利用Starbase数据库预测miR-629-3p可能参与的信号通路,分析预测结果并结合文献,确定miR-629-3p参与Wnt信号通路的作用,进一步分析Wnt信号通路中相关蛋白的表达水平(图4C)。

5. miR-629-3p参与信号通路中相关蛋白的表达

本实验通过体外细胞实验进一步验证miR-629-3p在头颈部肿瘤中的作用,沉默TU212细胞中miR-629-3p的表达,观察Wnt信号通路中相关蛋白的水平变化,结果显示Wnt、β-cantenin和Survivin的表达水平明显低于对照组的水平(NC组),差异具有统计学意义(P<0.05);而E-cadherin的表达水平与对照组相比,明显升高(P<0.05)(图5)。

图5 蛋白表达水平

讨 论

成熟的microRNA通过与多种蛋白质结合形成RNA诱导的沉默复合体,发挥其调控作用。某一种microRNA可以靶向调节多种基因的表达,某种基因的表达也可能受到多种microRNA的调控。研究发现,人类大约60%的基因都受到microRNA表达的调控。microRNA主要通过对靶基因的降解或抑制其翻译来调控靶基因的表达。研究表明,microRNA在调节生物体生长发育、新陈代谢及凋亡等各个方面均发挥重要作用[9-10]。microRNAs通过碱基互补配对的原则,与特定mRNA的3′端非编码区(3′UTR)的microRNA调控元件相结合,从而对靶基因进行识别。

miR-629定位于15q23,研究表明,miR-629可与相应靶基因mRNA的3′端非翻译区互补结合,从而调控细胞的生长和分化过程,各类肿瘤的发生发展与它们的表达失调密切相关[11]。实验研究发现,miR-629-3p可促进肺癌和乳腺癌的病程进展[12-13]。miR-629-3p可以通过调节PTP4A1和ERK1/2信号通路中相关因子的表达,抑制宫颈癌细胞的生物学功能[7]。miR-629-3p在人肺腺癌组织和细胞系中表达均上调,miR-629-3p通过下调SFTPC的表达可能会促进肺腺癌的疾病进展[12]。然而,关于miR-629-3p在头颈部肿瘤中的作用研究甚少。

本实验通过生信TCGA数据库,得出miR-629-3p在头颈部肿瘤组织中高表达。Nomogram列线图显示,5年的生存概率明显低于1年和3年的生存概率,ROC曲线图显示,miR-629-3p对于生存率的预测具有一定的准确性。推测miR-629-3p在头颈部肿瘤有可能作为一种致癌因素起作用。通过分析miR-629-3p与临床患者TNM分期的相关性,得出miR-629-3p与头颈部肿瘤患者的N和M分期具有一定的相关性。

免疫细胞在很大程度上参与了肿瘤细胞的浸润,本实验头颈部肿瘤中miR-629-3p的表达与T细胞、B细胞呈明显正相关,与NK细胞呈负相关,得出T、B及NK细胞的表达会影响头颈部肿瘤患者miR-629-3p的浸润水平。利用生信Starbase数据库预测结果并结合相关文献分析,确定miR-629-3p参与Wnt信号通路作用,从而进一步检测Wnt信号通路中相关蛋白的表达水平。Wnt信号通路可以调控胚胎干细胞、肿瘤干细胞、间充质干细胞等多种干细胞的不同生物学功能。Wnt是一类分泌型糖蛋白,Wnt信号途径能引起胞内β-catenin积累,对肿瘤细胞的增殖、分化和迁移起到一定的调节作用。β-catenin作为一种黏附分子在喉癌细胞中呈高表达状态,在基因的活化和转录过程中发挥重要作用,作为Wnt信号传导途径的核心元件,在胚胎发育阶段通过介导Wnt信号,促进下游靶基因的转录,还可以作为细胞黏附蛋白细胞骨架网络的结构组分,与肿瘤的发生、发展及转移过程密切相关。E-cadherin蛋白主要介导细胞与细胞间的黏附,其表达水平与肿瘤细胞的侵袭和转移能力呈负向相关。它的异常表达与肿瘤的形成、复发和转移有关。Survivin在细胞中呈周期依赖性表达,具有抑制肿瘤细胞凋亡、参与细胞周期调控的双重功能,可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性。

本实验为进一步验证miR-629-3p在头颈部肿瘤中的作用,通过Western blot法检测沉默miR-629-3p后,Wnt信号通路相关蛋白的表达,结果显示Wnt、β-catenin和Survivin的表达水平明显降低,而E-cadherin的表达水平明显升高,进一步验证了miR-629-3p在喉癌细胞中作为一种致癌因子存在。miR-629-3p有可能作为评估头颈部肿瘤患者病情及预后的指标,也为其靶向治疗提供相关的数据基础。