基于生物信息学数据库分析FOXM1 在肝癌中的表达及其临床预后意义

苏永发，陈金图

（福建医科大学附属泉州第一医院检验科，福建 泉州 362000）

肝癌是全球常见的恶性实体肿瘤之一，在我国存在高发病率和致死率[1-2]。肝癌起病隐匿，术后总体预后差[3-4]。其发生发展机制十分复杂,至今仍未明确,因此探索新的、有价值的肿瘤标志物对肝癌的诊疗及预后具有重要意义。

FOXM1 是属于Fox 家族的一种转录因子亚型，其表达及转录依赖于细胞周期分化过程[5]。FOXM1 能够调节肿瘤细胞一系列病理活动，包括增殖，侵袭及转移，因此FOXM1 的表达水平将为肿瘤的诊断和预后提供重要的指标[6-7]。相关研究发现FOXM1 在癌症，如宫颈癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢癌[10-12]、膀胱癌[13-14]等中异常高表达，逐渐成为肿瘤研究的热点，然而关于FOXM1 在肝细胞癌的研究较少。本研究主要采用生物信息的方法，挖掘分析Oncomine、GEPIA 和HPA 公共数据库中FOXM1在肝癌中的表达情况及其潜在的临床预后意义。另外，最近的大量实验研究发现，靶向的FOXM1抑制剂具有有效的抗癌作用，表明FOXM1 将有机会为抗癌药物开发和肿瘤治疗提供潜在的新靶标[15]。

1 资料与方法

1.1 Oncomine 数据库的在线分析 Oncomine 数据库（https://www.oncomine.org/）是采用基因芯片技术建立的肿瘤数据库[16]，其中一项重要功能就是进行肿瘤和正常组织的基因差异表达分析。本研究预设的检索条件如下：（1）目的基因: FOXM1；（2）分析类别：癌症组vs 正常组；（3）肿瘤类型：肝癌；（4）数据类型: mRNA；（5）样本类型：临床标本；（6）数据集筛选标准：P ＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top 10%。将所有结果汇总进行综合比较分析。

1.2 GEPIA 数据库的在线分析 GEPIA 数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）是一个可用于整合分析癌症表达谱数据的交互式分析网站[17]。本研究预设的检索条件如下：（1）“Expression DIY” 模块：Boxplot 中选择FOXM1 及Match TCGA normal data and GTEx data；Stage plot 中选择FOXM1、“Yes”Log Scale（2）“Survival”模块：Survival Plots 中选择FOXM1、Overall Survival 或Disease Free Survival；（3）“Correlation”模块：选择FOXM1 分别与MLH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5 和MSH6 等DNA 修复基因及PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A 和VEGFA等PI3K/AKT 信号通路关键分子进行相关性分析。

1.3 HPA 数据库分析FOXM1 蛋白表达差异 HPA在线网站（https://www.proteinatlas.org/）是一个利用各种组学和技术整合人体不同组织和器官的蛋白质表达图谱的网站[18]。本研究主要利用该网站分析FOXM1 在肝癌及肝正常组织的免疫组织化学染色情况及差异表达信息。

1.4 WB 进行相关蛋白验证 采用Western blot 检测FOXM1 过表达HepG2 细胞株错配修复基因及PI3K/AKT 信号通路关键分子蛋白表达水平，进一步验证生物信息学数据库分析结果。

1.5 统计学方法 采用t 检验分析肝癌组与正常组中FOXM1 基因表达差异，采用单因素方差分析方法进行不同临床阶段之间FOXM1 基因表达的比较，采用皮尔森统计方法对相关性进行分析，绘制Kaplan-Meier 曲线进行预后分析，P＜0.001 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肿瘤类型FOXM1 基因的表达情况 Oncomine 数据库中共提供455 项FOXM1 基因在不同类型肿瘤的数据集。其中FOXM1 表达差异有统计学意义的研究结果共有78 个，FOXM1 表达增高的研究有75 个，降低的仅有3 个。在常见的恶性肿瘤中，FOXM1 在肺癌的研究结果中高表达有11个，在乳腺癌和淋巴瘤的研究高表达各有8 个，结直肠癌的研究中高表达有6 个，在子宫颈癌的研究中高表达有4 个，在胰腺癌和胃癌的研究中高表达各有2 个，其中高表达于肝癌中的研究有4个。从图中我们还可以得到，Oncomine 数据库目前收集到的FOXM1 基因低表达的研究仅有3 个，均存在于白血病中，见图1。

图1 FOXM1 基因在Oncomine 数据库所有肿瘤研究中的表达

2.2 肝癌中FOXM1 基因的表达情况 Oncomine数据库显示自2002 年至今的研究中，其中有4 个子数据集对肝癌组与正常组进行分析，共760 例标本，见图2。对上述4 个数据集结果进行荟萃分析发现，与正常肝脏组织比较，FOXM1 基因在所有差异表达基因中的中位秩为272.5，P 值为1.18E-7，其差异显著，说明FOXM1 高表达于肝癌中。

图2 FOXM1 基因在Oncomine 数据库肝癌中的表达

2.3 不同肝癌研究中FOXM1 基因的表达情况 获取Oncomine 数据库中不同肝癌数据集与肝脏正常组织FOXM1 基因的表达数据，对相关数据作箱式图对比分析。FOXM1 mRNA 高表达于肝癌中（P均＜0.001），见图3。GEPIA 数据库中共检索到369例肝癌及160 例正常肝脏组织，包含FOXM1 mRNA 的表达含量信息，统计分析结果显示，GEPIA数据集分析结果与Oncomine 数据库相一致（P＜0.001），见图4。

图3 Oncomine 数据库FOXM1在不同肝癌研究数据集中的表达

图4 GEPIA 数据库FOXM1 在肝癌与正常组织中的表达差异

应用HPA 数据库在线分析了肝癌组织和正常组织FOXM1 的蛋白表达情况，验证蛋白与mRNA的表达差异水平是否一致。结果显示FOXM1 蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于正常组织，该蛋白染色结果与mRNA 表达一致。见图5。

图5 FOXM1 蛋白在肝癌组织及正常组织间的表达差异。A为正常肝组织FOXM1 蛋白表达；B 为肝癌组织中FOXM1 蛋白表达

2.4 FOXM1 基因表达水平与肝癌临床病理分期的关系 在GEPIA 数据库中分析FOXM1 基因表达与肝癌临床病理分期的关系，结果显示在不同的肿瘤临床分期各组间FOXM1 mRNA 表达差异均有统计学意义（P＜0.001），见图6。

图6 GEPIA 数据库FOXM1 基因在不同肝癌分期中的表达情况

2.5 FOXM1 基因表达水平与肝癌患者生存期的关系 从GEPIA 数据库获得364 例肝癌患者资料信息，进行Kaplan-Meier 生存曲线分析，其结果显示FOXM1 mRNA 表达水平对肝癌患者的总生存期和无瘤生存期均存在显著影响。FOXM1 高表达组患者比低表达组明显缩短（P 均<0,001）,见图7。

图7 GEPIA 数据库FOXM1 表达与肝癌患者预后的关系

2.6 FOXM1 基因表达量与错配修复基因表达的相关性 为探索FOXM1 在肝癌中的表达及影响临床预后的潜在分子机制，本文利用TCGA 数据分析对FOXM1 基因表达情况与MLH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5 和MSH6 等一系列错配修复基因的表达进行Pearson 相关性分析，我们发现FOXM1与MSH4 相关性低，而与MLH1、MSH2、MSH3、MSH5 和MSH6 基因的表达呈现显著正相关性（P均＜0.001），见图8A，其中与MSH2 和MSH6 相关性尤为显著。

图8 GEPIA 数据库FOXM1 表达与错配修复基因及PI3K/AKT 信号通路关键分子表达的相关性。

2.7 FOXM1 与PI3K/AKT 信号通路关键分子在肝癌中的表达相关性 采用GEPIA 数据库中相关性分析功能，分析在肝癌中FOXM1 与PI3K/AKT 信号通路的关联程度。皮尔森相关性分析结果显示，在肝癌组织中FOXM1 基因的表达与PIK3CA、mTOR、AKT1、HIF1A 及VEGFA 的表达均呈现正相关（P 均＜0.001），见图8B。

2.8 WB 验证FOXM1 过表达株中错配修复基因与PI3K/AKT 信号通路关键分子蛋白表达情况 本研究小组成功构建FOXM1 过表达HepG2 细胞株见图9A。采用Western Blot 进行蛋白检测。实验结果显示，相较于正常组，过表达组MLH1、MSH2、MSH3、MSH5、MSH6、PIK3CA、mTOR、AKT1、HIF1A和VEGFA 的表达水平在一定程度上有所提高，该结果与生物信息学分析结果相互验证。

图9 过表达FOXM1 HepG2 细胞株相关蛋白表达情况。注：A 为成供构建FOXM1 过表达株FOXM1 的表达水平；B 显示错配修复基因蛋白表达水平；C 显示PI3K/AKT 信号通路关键蛋白表达水平。

3 讨论

大量临床研究显示FOXM1 是具有细胞增殖特异性的肿瘤细胞转录因子。本研究通过检索大型癌症公共数据库中肝癌组织FOXM1 的表达数据，深度挖掘分析了FOXM1 在肝癌中的表达水平及其临床预后意义。Oncomine 和GEPIA 的数据均显示了FOXM1 基因在肝癌中的表达水平明显高于正常组织。HPA 在线检索网站发现，FOXM1 在肝癌中的蛋白表达水平呈现高表达状态，该结果与上述两个数据库FOXM1 mRNA 分析结果相互验证。本研究发现FOXM1 与肝癌患者临床预后密切相关。这一结果与Zhao 等[11]的研究发现存在相似之处。大量研究发现FOXM1 在肿瘤化疗耐药中起着至关重要的作用。Zhou 等[12]研究发现FOXM1在卵巢癌耐药标本中高表达，增强卵巢癌细胞对化疗药物顺铂的耐药性；Okada 等[19]研究发现在接受化疗治疗的晚期胃癌患者中FOXM1 过表达与多西紫杉醇耐药性显著相关。Liu 等[20]发现非小细胞肺癌中FOXM1 的阳性表达率与顺铂敏感性和预后不良有关，提示FoxM1 在顺铂耐药中起关键作用。本研究验证了FOXM1 转录因子表达水平与肝癌临床分期的关系。通过GEPIA 数据库分析，发现有显著差异。后续研究中，可以对其进一步展开探究。

肝癌是由遗传和环境因素引起的复杂疾病。基因组不稳定是其发生的关键性因素之一。错配修复基因（Mismatch repair，MMR）是一组遗传相关基因，任意一个基因突变，将影响DNA 碱基错配修复功能，引发肿瘤。通过GEPIA 数据库相关性分析功能，本研究对FOXM1 分别与MSH2 等错配基因一一进行分析验证，发现与MLH1、MSH2、MSH3、MSH5 和MSH6 基因的表达呈现显著正相关性。PI3K/AKT 信号通路参与调节细胞增殖分化。采用GEPIA 数据库相关性分析功能，本研究分析了肝癌中FOXM1 与PI3K/AKT 通路关键性分子的表达相关性，为后续肿瘤发生分子机制的探究提供参考依据。本研究使用大型癌症数据库分析了FOXM1 转录因子在HCC 中的表达及其临床预后意义及其相关分子机制，探索其作为肝癌预后的新标志物和基因治疗靶标的潜能。大量研究证明，单一的肿瘤标志物无法及时、有效地辅助肿瘤诊断。本研究小组后期将联合FOXM1、AFP、GP73 及DCP 等肝癌辅助诊断项目，进一步探寻更为有效的肿瘤标志物组合，帮助临床实现早期诊断与治疗。