抗性糊精对慢性不可预知温和应激大鼠肠道菌群的影响

雷 静,张馨予,陈立军,王大宁,孟 斌,温晓昶,王江平

研究发现,抑郁症患者肠道菌群的组成及代谢物发生明显变化[1,2],将抑郁症患者的肠道菌群移植给正常小鼠可表现出抑郁样症状[3,4],提示肠道菌群的改变可能是抑郁症发病机制的始作俑者[5-7]。抗性糊精是一种耐受性极好的可溶性纤维[8],可调节肠道菌群,改变其组成及活性[9,10]。本研究选用抗性糊精对大鼠抑郁模型进行干预,分析其抗抑郁作用,旨在为抑郁症研究及治疗提供参考。

1 对象与方法

1.1 实验动物及主要试剂 健康雄性SD大鼠,体重200 g[斯贝福(北京)生物科技有限公司,动物生产许可证SCXK(京)2019-0010]。大鼠饲养于SPF级动物实验室,温度控制在22～24 ℃,湿度50%,每12 h明暗交替光照,水和食物自由摄取。AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司);抗性糊精(北京华澳康达生物科技有限公司);QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)。本研究获得天津市南开医院实验动物伦理委员会批准(批准号NKYY-DWLL-2020-145)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 大鼠随机分为三组:对照组、模型组和抗性糊精组。每组8只。抗性糊精组:抗性糊精粉末溶于生理盐水,灌胃(5 ml/kg);对照组和模型组:灌胃相同体积的生理盐水,1次/d,持续21 d。对照组大鼠正常饲养,不接受任何刺激。模型组和抗性糊精组均接受7种应激刺激:禁水、水平震荡、禁食、夹尾(距尾根部1 cm处)、冷水游泳、45 ℃烘箱热烘以及黑白颠倒,每种刺激均实施3次,每天随机给予一种,且相同刺激不连续两天出现。造模结束后,对所有实验动物进行糖水偏好实验和旷场实验,计算糖水偏爱率(%)=1%质量体积分数的蔗糖水消耗量(ml)/总饮水消耗量(ml)×100%,记录大鼠在矿场箱中的活动(穿越格数+直立次数)。然后10%水合氯醛麻醉大鼠,收集大鼠肠道内容物于冻存管中,液氮冻存。

1.2.2 16S rRNA高通量测序 以行为学指标为依据,每组筛选4只大鼠进行高通量测序。提取大鼠肠道内容物细菌总DNA,对V3-V4可变区进行PCR扩增。扩增产物进行电泳检测并用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收目标片段。回收产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量,按照每个样本的测序量要求,进行相应比例的混合。使用NEB Next® UltraTMDNA Library Prep Kit建库试剂盒进行文库构建,并通过Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit进行质检,文库质检合格后采用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行测序[11]。对原始数据处理后得到的有效数据进行生物信息学分析。

2 结 果

2.1 肠道菌群的多样性分析 α多样性指数进行评估,结果表明组间肠道微生物群落多样性无显著性差异(Ace指数P=0.8;Chao1指数P=0.81;Shannon指数P=0.78;Simpson指数P=0.28)。β多样性主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)结果表明对照组与模型组菌群结构组成差异明显;抗性糊精组菌群结构组成偏离模型组,接近对照组。表明抗性糊精可改善CUMS大鼠肠道菌群结构组成和多样性。

2.2 不同分类水平肠道菌群的组成分析

2.2.1 门水平肠道菌群组成 三组样本中门水平的大鼠肠道菌群共鉴定出包括厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)在内的19个菌门。 与对照组相比,模型组大鼠肠道菌群厚壁菌门相对丰度显著降低[(0.92251±0.02838)vs.(0.82572±0.00761),P<0.05],拟杆菌门相对丰度显著升高[(0.04671±0.00263)vs.(0.12341±0.03576),P<0.05];与模型组相比,抗性糊精组大鼠肠道菌群厚壁菌门相对丰度显著升高[(0.82572±0.00761)vs.(0.93276±0.03284),P<0.01],拟杆菌门相对丰度显著降低[(0.12341±0.03576)vs.(0.04708±0.00284),P<0.05]。

2.2.2 属水平肠道菌群组成 在属水平,与对照组相比,模型组大鼠肠道菌群厚壁菌门、阿克曼菌属(Akkermansia)[(0.01327±0.00076)vs.(0.00000±0.00000)]、乳球菌属(Lactococcus)[(0.00029±0.00010)vs.(0.00000±0.00000)]相对丰度显著降低(P<0.05);粪杆菌属(Faecalibaculum)[(0.00011±0.00004)vs.(0.00057±0.00005)]、Ruminococcaceae_UCG_014[(0.01003±0.00384)vs.(0.10976±0.04364)]相对丰度显著升高(P<0.05)。与模型组比较,抗性糊精可显著回调上述菌属(P<0.05,表1)。

表1 三组大鼠肠道菌群属水平相对丰度对比

(续表)

2.3 标志菌群分析 为了找出不同类群中的优势菌群,本研究采用线性判别分析(linear discriminant analysis effect size,LDA effect size),该分析方法强调统计意义和生物学相关性。对照组和模型组、模型组和抗性糊精组分别鉴定出有统计学意义的标志菌群(LDA Score>2,图1)。通过分析发现Ruminococcaceae_UCG_014是模型组的标志菌群,阿克曼菌属和乳球菌属是对照组和抗性糊精组的标志菌群。

图1 三组大鼠标志菌群线性判别分析

3 讨 论

3.1 构建模型 抑郁症受多种因素的影响[12],应激是抑郁症产生的重要因素之一。动物模型是识别抑郁症发病机制和研发新的药物以及治疗方法的最有效途径[13,14]。其中CUMS模型更好地模拟了抑郁症的核心症状,与人类现实生活中常见应激事件的强度相符[11],作用持久且稳定,被认为是目前最经典的抑郁症动物模型[15]。近年来研究发现,抑郁症的各种发病机制假说可能来源于肠道菌群的改变[5-7]。微生态调节剂主要有益生菌和益生元两大类。益生菌具有改善体内微生态平衡的作用,但是作为活的生物治疗方法需考虑储存方法、胃酸的影响、抗生素的影响以及是否有致病性等问题[16]。益生元可调节机体肠道微生态,促进健康。且与益生菌相比,不用考虑上述问题。抗性糊精作为益生元,是一种以淀粉为原料制成的水溶性膳食纤维,具有抗消化酶解等特性。因此笔者选用抗性糊精对其是否可改善抑郁症进行探讨研究。

应激是正常的心理反应。适当的应激可提高机体的环境适应能力, 但过度应激可导致机体产生心理障碍[17]。越来越多的研究发现,相同条件下实验动物之间会出现应激敏感和应激抵抗两种应激状态,该现象恰好与人类不同个体间的异质性相似。即面对现实生活中的各种应激事件,不同个体之间会出现不同的应激状态[18]。鉴于抑郁模型的实验数据存在很大的离散度[19],因此本研究基于抑郁模型的客观数据筛选应激敏感的动物样本进行16S rRNA高通量测序,分析抗性糊精对CUMS大鼠肠道菌群的影响。

3.2 抗性糊精对CUMS大鼠肠道菌群的影响 临床研究表明,抑郁症患者与对照组的肠道菌群存在显著差异[20],相较于对照组,抑郁症患者的肠道微生物群多样性和丰度都明显下降[21]。本研究结果显示,不同组间肠道菌群的组成结构均发生显著变化。通过分析发现:在门水平,模型组肠道菌群的厚壁菌门相对丰度降低,拟杆菌门的相对丰度升高,这与之前的抑郁动物以及抑郁患者的肠道菌群研究一致[22]。厚壁菌门和拟杆菌门是肠道菌群中所占比例最高的两个菌门,两者的比值(厚壁菌门/拟杆菌门)在一定程度上可以反映机体的健康状态[23]。本研究结果显示抗性糊精能够调节拟杆菌门以及厚壁菌门的相对丰度。在属水平,模型大鼠肠道菌群的阿克曼菌属、乳球菌属相对丰度显著降低。阿克曼菌属是存在于人体肠道中的一种益生菌[24,25]。有研究发现阿克曼菌属在抑郁症中的丰度显著降低,并与下丘脑中的5-羟色胺水平呈显著正相关。5-羟色胺与抑郁症密切相关,目前临床上一些抗抑郁药是针对5-羟色胺从而改善抑郁症状[26,27]。此外,本研究在对不同组别标志菌群分析时也发现,阿克曼菌属是对照组和抗性糊精组的标志菌群。因此,阿克曼菌属很可能成为治疗抑郁症的潜在靶点。此外,研究发现模型组大鼠粪杆菌属、Ruminococcaceae_UCG_014相对丰度显著升高。两者均可产生丁酸,丁酸是一种短链脂肪酸,可以加强上皮防御屏障,减少肠道炎症。与粪球菌属一起,粪杆菌属始终与较高的生活质量指标相关,在抑郁症患者中明显减少[28]。以往的研究结果显示,粪杆菌属与抑郁症呈负相关,但潜在机制尚不清楚[29]。有研究表明,慢性应激后粪便中次级胆汁酸水平的增加与Ruminococcaceae_UCG_014丰度呈正相关,次级胆汁酸生物合成途径的异常激活可能会促进CUMS小鼠的代谢紊乱和疾病进展[30]。同时,Ruminococcaceae_UCG_014是模型组的标志菌群。抗性糊精可以抑制上述菌属相对丰度的升高。以上结果表明抗性糊精可以调节抑郁大鼠的肠道菌群组成,促使肠道恢复动态平衡。

综上所述,抗性糊精可能通过调节肠道菌群发挥抗抑郁作用,为抑郁症的治疗提供新的思路。然而,本研究仅发现抗性糊精可调节不同水平肠道菌群相对丰度的变化,但其干预肠道菌群的作用机制尚不清楚,课题组后续将对抗性糊精影响抑郁症的机制进行探讨研究,为促进健康、防治疾病提供更多科学有效的方案。