RIG-I/NF-κB 信号通路在老龄小鼠围术期神经认知障碍中的作用

杨玉东， 董 东， 阎文军

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏回族自治区人民医院麻醉科，银川 750002； 3.甘肃省人民医院麻醉手术科，兰州 730000）

围术期神经认知障碍（perioperative neurocognitive disorders，PND）是围术期严重并发症，主要表现为学习和记忆、注意力、执行功能、语言思维、知觉运动、社会认知等能力下降[1-2]。PND 导致术后1～6 个月的病死率增加，且发病率高，严重影响患者的术后恢复质量，使其住院时间延长、医疗费用增加，甚至可能导致长期的认知功能障碍，但其发病机制尚未完全阐明[3]。研究[4-5]表明，由手术创伤引起的外周炎症和全身炎性介质的释放会影响中枢神经系统的炎症过程，并且这些炎性介质水平的高低与认知功能障碍的严重程度相关，尤其是在记忆和学习方面。维甲酸诱导基因I（RIG-I）是一种RNA 解旋酶，被认为是一种重要的细胞内模式识别受体，通过识别病毒与细菌的RNA 和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），导致核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的激活，从而发挥抗病毒和抗菌的先天免疫反应。据报道[6]，RIG-I/NF-κB 信号通路与神经炎性反应关系密切，故其过度激活可能通过导致脑内促炎因子级联式增加，引起神经细胞损伤，从而对认知功能产生影响，但抑制该通路是否可以改善PND 仍不明确。因此，本实验旨在探讨RIG-I/NF-κB 信号通路在老龄小鼠PND 中的作用及其潜在机制，为PND 提供新的分子靶点和治疗策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

50 只15 月龄雄性野生型C57BL/6J 小鼠饲养于南京拉姆达医药有限公司［实验动物使用许可证编号：SYXK（苏）2021-0038］，并由南京拉姆达医药有限公司实验动物伦理委员会批准（批准文号：IACUC-20220608），所有相关实验方法与操作均严格遵守伦理规范。经Morris 水迷宫实验筛选出无学习能力障碍的36 只小鼠，于第7 天进行分组和造模。采用随机数表法将小鼠平均分为4 组：空白组（C 组）、假手术组（Sham 组）、PND组、RIG-I-/-+PND 组，每组9 只。C 组不做任何处理，其他组在腹腔注射4%水合氯醛麻醉后切开小腿皮肤，Sham 组不做胫骨骨折处理，0.9%生理盐水冲洗后逐层缝合伤口；PND 组、RIG-I-/-+PND 组进行胫骨骨折髓内钉内固定手术处理，应用利多卡因注射液镇痛后缝合。RIG-I-/-+PND 组于术前和术后第3 天经海马注射RIG-I-siRNAs［通用生物（安徽）股份有限公司，中国］各1 次。注射时将siRNA 以5 nmol/20 g 的浓度溶解于RNase-free 水中，将小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪（南京卡尔文生物科技有限公司，中国），沿颅骨中线切开皮肤，暴露颅骨并消毒后，用定位仪推进器将头皮针插入颅骨小孔下约2 mm 处进行注射。每只小鼠注射体积为50μL，注射时间>90 s，留针时间约30 s，注射期间保持注射管道系统的通畅及封闭。注射用RIG-I-siRNA 序列如下：正向引物：5’-GCCAUGCAACAUAUCUGUAAAdTdT-3’；反向引物：5’-UUUACAGAUAUGUUGCAUGGCdTdT-3’。

1.2 胫骨骨折髓内钉内固定手术

胫骨骨折髓内钉内固定术用于建立PND 模型[7]。腹腔注射5%水合氯醛（博士德生物工程有限公司，中国）0.5 mL/100 g 麻醉小鼠。待小鼠翻正反射消失后，将其固定于手术台（瑞沃德生命科技有限公司，中国）上，备皮、使用碘伏消毒小鼠右下肢，铺巾后于右侧膝关节下切开约0.5 cm 皮肤，逐层分离，暴露胫骨。将0.3 mm 的髓内固定针插入髌腱，充分固定后用手术钳于胫骨中上1/3 处断裂胫骨骨干，立即使用0.9%生理盐水冲洗后再将固定针完全插入并对合。清创后逐层缝合伤口，手术切口周围以0.2%利多卡因胶浆局部浸润镇痛，包扎后将小鼠置于电热毯（三春电器有限公司，中国）上复苏，待其苏醒后送回动物房正常饲养。手术时间约30 min，全程无菌操作，术中室温维持在24～26 ℃，直肠温度维持36.5～37.5 ℃。

1.3 组织样本采集

小鼠术后第1、3、7 天Morris 水迷宫行为学测试结束后，每组随机取3 只小鼠麻醉后使用脊椎脱臼法处死，剥离小鼠大脑皮质，快速分离海马组织。将分离的海马组织置于培养皿中，用1×PBS 洗涤3 次，以去除杂质。随后液氮速冻，-80 ℃保存备用[8]。

1.4 Morris 水迷宫实验

Morris 水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验，分别于术前和术后进行[9-10]。术前用于剔除学习能力异常的小鼠，术后用于评价RIG-I基因沉默对于PND 小鼠认知能力的影响。空间认知能力差异无统计学意义的4 组小鼠于术后第1、3、7 天进行逃避潜伏期、目标象限停留时间及穿越平台次数测试。每次实验分别从4 个象限的固定点将小鼠面向池壁放入，记录其找到平台的时间（逃避潜伏期），60 s 内未找到平台的潜伏期记为60 s。定位航行实验结束后，撤掉水下平台，将小鼠从原平台对角象限面向池壁放入，记录60 s 内其在原逃生平台所在象限的停留时间（目标象限停留时间），以及在该时间内穿越原平台位置的次数（穿越平台次数）。实验期间使用路径追踪系统采集小鼠游泳轨迹（Noulds，EthoVision 14.0，荷兰）。

1.5 ELISA 测定海马组织炎性因子含量

-80 ℃冻存的海马组织用无菌手术剪刀剪碎，按质量（g）∶体积（mL）=1∶9 加入1×PBS 液，利用玻璃匀浆器将组织制成匀浆，4 ℃、12 000 r·min-1，离心10 min，收集上清液。采用ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，中国）检测术后第1、3、7 天海马组织上清液中炎性因子白细胞介素（interleukin 1β，IL）-1β、IL-6 以及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。具体步骤按照ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）说明书进行操作：将样本按1∶4 稀释后，分别加入小鼠IL-1β、IL-6 或TNF-α 捕获抗体包被的固相抗体微孔板。结合后加入HRP 酶标记抗体，最后用TMB 显色。用多功能酶标仪（M3 公司，美国）在450 nm 波长下测定光密度（OD）值，根据标准品梯度稀释绘制标准曲线，并根据标准曲线计算小鼠海马组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平。

1.6 Real-time qPCR 检测小鼠海马组织RIG-I基因表达水平

按TRIzol 试剂说明书（Invitrogen 公司，美国）操作步骤，提取海马组织中总RNA。总RNA在OD 260 nm 处测定RNA 浓度，OD 260/280 nm处检测抽提的RNA 纯度。根据试剂盒说明书，使用cDNA 第一链合成试剂盒（TaKaRa RR036B，日本）进行反转录和One Step TB GreenPrime－ScriptTMRT-PCR KitⅡ（SYBR Green，TaKaRa 公司，日本）进行cDNA 片段扩增。0.1 mL PCR 管中，依次加入如下组分混合成20 μL 反应体系：10 μL 2×Real-time PCR Master Mix、1 μL 8 倍稀释的cDNA 模板、2 μL 引物Mix 及7 μL 0.1% DEPC水。随后使用荧光定量PCR 循环仪（ABI Step one plus Real time-PCR system，美国），设置95 ℃预热5 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共40 次循环。RIG-I 和GAPDH 内参引物使用Primer 6 设计，由通用生物（安徽）股份有限公司合成，引物序列见表1。2-ΔΔCt法用于计算基因相对表达量。

表1 qPCR 引物序列

1.7 Western blot 检测小鼠海马组织RIG-I 和NF-κB p65 的表达

使用全蛋白抽提试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，KGP250，中国）提取冻存的小鼠海马组织中的总蛋白，具体步骤按照产品说明书操作。用BCA 蛋白含量检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，KGP250，中国）定量蛋白浓度。蛋白加热变性后等体积上样，用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%分离胶、5%浓缩胶）分离蛋白后，转移至硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC）。NC 膜在常温下用5%脱脂牛奶封闭2 h 后，移入4 ℃分别同抗兔RIG-I（Cell Signaling Technology 公司，美国，1∶1 000）、抗兔NF-κB p65（Abcam 公司，美国，1∶1 000）或抗兔GAPDH 一抗（江苏凯基生物技术股份有限公司，中国，1∶5 000）摇床振荡孵育过夜。次日，加入对应抗兔HRP 酶标IgG 二抗（江苏凯基生物技术股份有限公司，中国，1∶1 000）常温孵育2 h 后使用增强化学发光试剂显色。ChemiDoc MP Imaging System（Bio-rad 公司，美国）用于成像，Gel-Pro 32 软件（Media Cybernetics 公司，美国）进行灰度分析。

1.8 统计学方法

数据应用SPSS 25.0 软件进行统计分析，GraphPad Prism 9.0 软件绘制柱状图。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RIG-I 基因沉默改善老龄PND 小鼠神经认知障碍

老龄小鼠连续5 d 进行定位航行训练帮助形成空间记忆后，筛选记忆功能无障碍的小鼠纳入实验。术后第1、3、7 天分别对各组进行Morris水迷宫空间探索实验。实验结果显示，与Sham 组相比，术后第7 天PND 组老龄小鼠逃避潜伏期延长（图1A），目标象限停留时间缩短（图1B），穿越平台次数减少（图1C）（P均＜0.05），表明手术创伤可导致老龄小鼠术后围术期神经认知障碍。而RIG-I-/-+PND 组与PND 组相比，逃避潜伏期缩短（图1A）、目标象限停留时间（图1B）及穿越平台次数增加（图1C）（P 均＜0.05），该3 项指标RIG-I-/-+PND 组和C 组或Sham 组间差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。提示RIG-I 基因沉默对PND 老龄小鼠的空间记忆学习功能障碍有积极的改善作用，能使其接近于正常水平。

图1 RIG-I 基因沉默后老龄PND 小鼠的Morris 水迷宫实验结果

2.2 RIG-I 基因沉默对老龄PND 小鼠海马组织中RIG-I 基因表达水平的影响

如图2 所示，利用RT-qPCR 检测各组小鼠海马组织中RIG-I 基因的表达水平。结果发现，与Sham 组相比，第7 天PND 组中RIG-I 基因水平更高（P<0.001）。且RIG-I 基因在RIG-I-/-+PND 组表达低于PND 组，该趋势在术后第3 天（P<0.05）和第7 天（P<0.001）的检测中均得到了证实，说明RIG-I-siRNA 注射海马可以成功沉默PND 小鼠海马中高表达的RIG-I 基因。

图2 RT-qPCR 检测RIG-I 基因沉默后PND 小鼠海马组织中RIG-I mRNA 表达变化

2.3 RIG-I 基因沉默对老龄PND 小鼠海马组织RIG-I 与NF-κB p65 蛋白表达的影响

通过Western blot 对RIG-I 与NF-κB p65蛋白进行检测，结果发现，在术后第7 天，RIG-I 和NF-κB p65 蛋白水平在PND 组中的表达均高于Sham 组和对照组（图3A 和图3B），而RIG-I-/-+PND 组则低于PND 组（P 均<0.05），提示PND 可能与RIG-I/NF-κB 通路激活有关，而RIG-I 基因沉默对PND 小鼠的影响可能通过对该信号通路的抑制来实现。

图3 Western blot 检测RIG-I 基因沉默后PND 小鼠海马组织中RIG-I 与NF-κB p65 蛋白水平的变化

2.4 RIG-I 基因沉默对老龄PND 小鼠海马组织中炎性因子水平的影响

与Sham 组相比，术后第3 天起，PND 组小鼠海马组织中IL-6（图4A）、TNF-α（图4B）以及IL-1β（图4C）水平均升高（P 均<0.05），而RIGI-/-+PND 组与PND 组相比，IL-6、TNF-α 及IL-1β 炎性因子浓度均降低（P 均<0.05）。术后第7 天的检测结果也呈现出相似的趋势，PND 组小鼠炎性因子比Sham 组小鼠升高，而与PND 组比较RIG-I-/-+PND 组降低（P<0.05）。以上结果表明，海马注射RIG-I-siRNA 能够改善手术后海马组织的炎性反应。

图4 ELISA 检测RIG-I 基因沉默后PND 小鼠海马组织中炎性因子水平的变化

3 讨论

PND 是老龄患者在麻醉和手术后最常见的并发症之一，以各种形式的认知功能障碍为特征。尽管其发病的相关机制尚不清楚，但神经炎症已被证明是最主要的原因之一[1]。RIG-I/NF-κB信号通路作为神经炎症的重要调控途径[9]，其在PND 发生发展中的直接作用却在国内外鲜有报道。本研究报道了抑制RIG-I/NF-κB 信号通路对PND 小鼠的认知功能障碍和神经炎症水平有明显的改善作用。

PND 临床前研究依赖于良好的动物模型。目前PND 模型的建立虽然有多种方法可以实现，但没有统一的标准。常用的造模方法主要包括肝部分切除术、脾切除术、肾切除术、剖腹探查术、单侧颈动脉暴露手术、LPS 诱导建模、单纯麻醉因素建模及胫骨骨折术[10]。其中，麻醉暴露和手术引起的神经炎症被认为是认知能力下降的主要原因。在通过手术方式造模的方法中，虽然特定的器官切除术和剖腹探查术都被证明可以成功诱导PND，但前者可能导致器官功能失代偿[11]，后者可能导致肠道菌群平衡失衡[12]，从而影响PND形成机制的准确判断。而胫骨骨折髓内钉内固定手术既能通过形成创伤，增加全身压力和释放炎性因子，从而作用于认知功能，又可避免对机体整体功能的损害，且术后实验对象生存率较高，因此在本实验中被采用[13]。本研究在4%水合氯醛麻醉下行胫骨骨折髓内钉内固定术后，第7 天可发现小鼠PND 模型制备成功，为胫骨骨折术在PND 建模的可行性方面提供了证据。但据报道[14]，对C57BL/6 小鼠行胫骨髓内钉置入术后，第2 天进行Morris 水迷宫实验发现小鼠活动及参考记忆未发生改变，这与本实验研究结果有一定差异。本研究术后第1 天，水迷宫实验检测结果显示，虽然目标象限停留时间和穿越平台次数在各组间差异无统计学意义，但PND 小鼠术后的逃避潜伏期相比空白组延长，这可能与动物模型月龄有关。相比本实验使用的老龄小鼠，在过往实验中使用的2 月龄小鼠，PND 进程发生了推迟，这也证明了年龄与其相关，提示在PND 建模应用过程中需要考虑到年龄的因素。

RIG-I 是一种由DDX58 基因编码的胞质模式识别受体，通常被认为是先天免疫中用于识别已感染病毒细胞的重要分子，存在于大多数细胞中，通过IFN1 的激活促进先天免疫，帮助激活适应性免疫系统[15]。在不同的微环境中，它具有除病毒识别之外的更多功能，包括在癌症中诱导免疫原性肿瘤细胞死亡和刺激促炎细胞因子的产生[16]，以及被证明在阿尔茨海默病患者的星形胶质细胞中与淀粉样蛋白前体蛋白和淀粉样蛋白-β 的表达增加有关[17]。Morris 水迷宫实验结果显示，尽管手术成功诱发了PND，但RIG-I 基因沉默的PND 小鼠的术后空间学习记忆能力下降。进一步检测了其下游相关信号因子的蛋白表达水平，结果显示，PND 的发生发展与RIG-I 和NF-κB p65 呈正相关，而RIG-I 基因的沉默一定程度上抑制了该通路的激活，且抑制了炎性因子的释放，从而通过神经炎症的缓解改善神经损伤及认知功能。NF-κB 代表的诱导型转录因子家族调节参与炎性反应过程中的大量基因，包括NFκB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB 和c-Rel 共5 个成员，它们通过结合特定的DNA 元件和κB 增强子形成二聚体来介导靶基因的转录，除了介导先天免疫细胞中各种促炎基因激活外，还调节炎性T 细胞的功能[18]。尽管潜在机制还未完全阐明，但RIG-I 已被多项研究证明可作为NF-κB 信号转导的正调节剂，对于调节NF-κB活性和蛋白质翻译有重要作用[19]，本研究中，RIG-I抑制的小鼠中发现的p65 蛋白下调也证明了这一观点。其原因是p50/p65 二聚体是RIG-I/NFκB 通路经典途径激活的最丰富的形式，它的介导作用通常由IKK 的NEMO 依赖性激活触发，随后IκB 蛋白的磷酸化及泛素化引起蛋白酶体降解释放p65。p65/输入蛋白-β 复合物通过Ran-GTP 蛋白转移到核内后解离成游离p65，通过结合目标基因的特定核苷酸序列来控制转录程序，其蛋白表达与NF-κB 的活化程度呈正相关[20]。本研究中，小鼠通过手术造成的创伤和全身压力源激活RIG-I/NF-κB 在内的一系列促炎相关通路扩大了炎性反应，共同破坏血脑屏障导致的神经炎症诱导了PND，但这一结局由于RIG-I/NFκB 通路的抑制而逆转。Kan 等[21]也报道过在NFκB 信号通路阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯可在临床前PND 模型中改善认知表现。

既往研究[22]发现，手术创伤的全身炎症可通过损伤相关分子模式、补体级联和凝血级联反应引起神经系统炎症，进一步诱导中枢神经胶质的激活。小胶质细胞和星形胶质细胞的激活可促使它们分泌炎性细胞因子[23]。海马CA1 区IL-1β 和TNF-α 的分泌与多种信号通路有关，例如，CCL2/CCR2 信号通路[24]，而本研究证实，RIG-I 也通过激活NF-κB 参与其中。另外有研究[25]显示，PND大鼠模型中，NF-κB 信号通路通过激活小胶质细胞导致IL-6、IL-1β 和TNF-α 上调和认知功能障碍，这也与本研究的结果一致，说明RIG-I 基因沉默可以通过下调NF-κB 而抑制这些炎性因子表达。这些细胞因子在神经炎症的发展过程中，导致突触可塑性受损，进一步引起认知功能障碍，但可以通过抑制RIG-I 来改善其发生水平，从而为调控认知功能障碍提供靶点。但这些炎性因子特异性很低，与其他疾病同样有关[26]，无法准确预测PND，所以何种细胞因子组合对于PND 预测具有更好的敏感性和特异性仍然有待探究。

综上所述，小鼠海马组织RIG-I 基因沉默可以通过下调老龄PND 小鼠海马组织RIG-I 的表达和抑制下游NF-κB p65 的激活，降低IL-6、IL-1β 和TNF-α 促炎因子水平，抑制神经炎性反应，从而改善胫骨骨折髓内钉内固定术引起的老龄大鼠认知功能障碍。抑制RIG-I 的表达可能为防治PND 提供新的思路和靶点。