孕期慢性不可预知温和应激致产后抑郁的实验模型验证

金素慧， 李泓谕， 李佳琪， 王 瑞， 刘红娅， 关素珍

（1.同心县人民医院，同心 751300； 2.宁夏医科大学公共卫生学院，银川 750004； 3.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004）

随着生活节奏的加快，女性在妊娠阶段，既面临着孕期及产后心理状态的改变，又需应对此阶段诸多因素作为应激源带来的压力，孕期女性常处于较高程度的压力状态，而经历负面生活事件的产妇患产后抑郁症（postpartum depression，PPD）的可能性更大。PPD 是产后出现过分焦虑、悲伤、绝望、快感丧失等情绪，甚至可能出现自杀或杀婴的行为，是一种常见的产褥期精神障碍性疾病，国内发病率为13.1%～16.3%[1]。研究[2]表明，孕期压力事件是PPD 的重要危险因素。一般在产后2 周内多发，产后4～6 周症状明显，于产后6 个月开始症状逐渐缓解，约2/3 患者可于1年内康复，若再次妊娠，其复发率高达50%[3]。PPD 不仅对产妇的身心健康有着巨大影响，还可能对婴儿情感和认知发育造成损伤[4]。但目前关于PPD 的诊断多以问卷调查为主，缺少生物学诊断标志物，导致其难以被及时发现和治疗，故寻找可能的生物学标志物以了解致病机制尤为重要，而在实验机制的相关研究中更多的产后抑郁模型是以激素诱导法及长期母婴分离应激模型为主[5]，这些因素更多的是考虑产后环境及激素水平的改变，并未涵盖PPD 与孕期诸多因素影响的相关性。本研究将模拟孕妇在妊娠期经受的社会心理因素影响来建立产后抑郁模型，进而为后期从围产期出发研究产后抑郁发生的原因及机制提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物与分组

健康成年SD 大鼠购自宁夏医科大学实验动物中心，合格证编号：SYXK（宁）2020-0001。其中雌鼠32 只，体质量（240±20）g；雄鼠16 只，体质量（300±20）g。经宁夏医科大学实验动物中心实验动物福利伦理委员会审核（IACUC-NYLAC-2021-121）。适应性饲养1 周后，将32 只雌鼠随机分为对照组和模型组，每组16 只；将16 只雄鼠随机分为对照交配组8 只和模型交配组8 只。其中雌鼠单笼饲养，雄鼠每笼2 只饲养。

1.2 实验主要仪器及试剂

1.2.1 主要设备与仪器 电子天平［梅特勒托利多科技（中国）有限公司］；高速冷冻离心机（德国Thermo Fisher 公司）；-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo 生物技术有限公司）；超纯水制备机（力康生物医疗科技控股有限公司）；VICTOR NivoTMMultimode Plate Reader［珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司］。

1.2.2 实验试剂 大鼠皮质酮/肾上腺酮（CORT）ELISA 试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；大鼠雌二醇（estradiol，E2）ELISA 试剂盒（上海酶免生物科技有限公司）；蔗糖分析纯（天津市大茂化学试剂厂）。

1.3 建立孕期慢性不可预知温和应激模型

选择慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立动物模型[6]。应激方式包括：禁食禁水12 h；拥挤环境24 h（8 只合笼），笼具倾斜30° 24 h；潮湿环境24 h（湿度60%～70%）；冰水游泳5 min；30 min 摇晃（1 次/s）；行为束缚2 h；热应激5 min（42 ℃）；夹尾（距尾尖1 cm 处）2 min。模型周期为21 d，每天随机安排应激方式，保证7 d 内不出现相同的应激方式。交配过程：在应激第3 天（17：00），对照组模型组分别与对照交配组和模型交配组1∶2 合笼饲养，第2 天早晨检查雌鼠阴道涂片确定妊娠后，将雌雄分笼，雌鼠继续单笼饲养，雄鼠每笼2只饲养。

1.4 血浆皮质酮水平测定

孕期不同时间点尾静脉取血，采用ELISA 试剂盒，按说明书对血浆皮质酮水平进行检测，酶标仪在450 nm 波长处测量各孔的光密度（OD）值。

1.5 产后抑郁情绪测定

分别于产后1 周、3 周进行以下实验测定。

1.5.1 蔗糖偏好实验 通过动物甜味溶液的摄入量占总液体量的比重，评价抑郁情绪。实验开始前进行适应性训练，取两个相同的饮用瓶，其中一个放入1%蔗糖溶液，另一个放入纯水，同时将两瓶水放入笼中，训练24 h。训练结束后，动物禁食禁水24 h，开始正式实验。分别记录1 h 内纯水消耗量，1%糖水消耗量、液体总消耗量。计算1%蔗糖偏好百分比（1%糖水消耗量/液体总消耗量×100%）。

1.5.2 旷场实验 通过动物在不熟悉环境下的探索行为，评估动物的焦虑及紧张程度。旷场实验箱采用100 cm×100 cm×50 cm 的无盖敞箱，底部用记号笔画出25 个4 cm×4 cm 的小格。实验前1 天将动物饲养于旷场实验室内熟悉环境。将动物放入旷场中央，让其在敞箱内自主活动5 min，分别记录其在外周和中心运动的时长。每只动物测试结束后，清理旷场内的粪便，喷洒75%乙醇去除动物留下的气味。

1.5.3 悬尾实验 通过动物放弃挣扎的静止状态，评价抑郁情绪。将实验动物尾部固定悬挂于悬尾实验箱上，使其头部向下并与实验台保持约20 cm 的距离，记录其5 min 内静止时间。

1.5.4 强迫游泳实验 使用直径20 cm、高度40 cm 的圆柱形透明装置，加入22 ℃左右的水，保持水面高度为25 cm，将大鼠放入水中，记录其5 min 内静止时间。通过动物在水中的不动状态，评价抑郁情绪。

1.6 E2 水平测定

在应激第21 天、产后1 周、产后3 周尾静脉采血，分离血清，利用E2ELISA 试剂盒进行测定。酶标仪450 nm 波长测量各孔吸光度值，实验重复3 次。

1.7 统计学方法

数据使用SPSS 24.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t 检验，同一指标不同时点比较用重复测量方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 孕期应激刺激对血浆皮质酮水平的影响

应激第7 天、21 天模型组雌鼠血浆皮质酮水平高于同时点对照组，差异均有统计学意义（P 均＜0.05），表明孕期雌鼠处于慢性应激状态，见表1。

表1 孕期应激对雌鼠血浆皮质酮水平的影响（±s，ng·mL-1）

表1 孕期应激对雌鼠血浆皮质酮水平的影响（±s，ng·mL-1）

组别n应激前1 天应激第7 天应激第14 天应激第21 天对照组81.68±0.941.34±0.241.58±0.231.90±0.22模型组81.54±0.732.00±0.262.39±1.092.38±0.21 F 值0.07118.0652.60212.264 P 值0.7960.0030.1450.008

2.2 孕期应激对雌鼠产后情绪的影响

2.2.1 孕期应激对产后雌鼠旷场实验各指标的影响 与对照组相比，模型组产后1 周外周运动时长延长、中心运动时长缩短（P 均＜0.05），但产后3 周两组中心运动时间、外周运动时间差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见表2。

表2 孕期应激对雌鼠产后行为学各指标的影响（±s）

表2 孕期应激对雌鼠产后行为学各指标的影响（±s）

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2.2.2 孕期应激对产后雌鼠1%蔗糖偏好百分比的影响 产后1 周、3 周模型组1%蔗糖偏好百分比均低于对照组（P 均＜0.05），提示孕期应激会导致雌鼠产后出现快感消失的问题，见表2。

2.2.3 孕期应激对产后雌鼠悬尾实验指标的影响 模型组产后1 周、产后3 周的静止时间均高于对照组（P 均＜0.05），见表2。

2.2.4 孕期应激对产后雌鼠强迫游泳实验各指标的影响 产后1 周模型组静止时间长于对照组（P＜0.05）。在产后3 周，模型组静止时间与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 孕期应激致产后E2 水平变化

经重复测量方差分析，组间比较发现模型组与对照组E2水平存在差异（F=6.273，P＜0.05），产后对照组和模型组E2水平均下降，且模型组产后1 周和产后3 周E2水平均低于对照组（P 均＜0.05）。提示孕期应激使产后雌鼠E2水平迅速降低，见表3。

表3 孕期应激对雌鼠E2 水平变化的影响（±s，pmol·L-1）

表3 孕期应激对雌鼠E2 水平变化的影响（±s，pmol·L-1）

组别n 应激第21 天产后第1 周第3 周对照组840.49±4.48 39.36±6.00 38.40±6.63模型组838.10±2.94 33.29±0.86 29.19±2.55 F 值1.1916.04310.071 P 值0.3010.0340.010

3 讨论

PPD 的影响因素有很多，包括经济、社会、遗传、生理等多种因素[7-8]。孕期慢性不可预知温和应激模型是Willner 通过改变动物生存环境（如禁食、禁水、潮湿垫料等）使动物长期处于应激状态建立的经典抑郁模型，其建立原理是动物处于不适宜生存环境时会出现紧张、焦虑、抑郁等情绪，有研究[9]表明CUMS 会导致下丘脑-垂体－肾上腺（HPA）轴功能失调。可见孕期慢性应激抑郁模型与临床PPD 患者的病因相似。PPD 的病程持续时间较长，可长达半年至1 年[10]，CUMS 可使动物的抑郁情绪持续时间较一般应激模型更长。此外CUMS 造模方法可靠、稳定、可操作性强，因此本研究选用慢性不可预知温和应激建立PPD动物模型。

慢性压力在抑郁症的发病过程中发挥着重要作用，当机体产生长期的应激，就会导致HPA功能障碍，糖皮质激素是HPA 轴激活的标志，而皮质酮是糖皮质激素的主要成分[11-12]，因此血浆皮质酮常作为慢性应激模型建立成功的指标。本研究模型组雌鼠应激第7 天、应激第21 天血浆皮质酮水平高于对照组，表明雌鼠处于应激状态，孕期慢性应激模型建立成功。在应激后期模型组雌鼠血浆皮质酮水平增长缓慢，可能与HPA轴对应激的适应有关。有研究[13]发现慢性应激开始时血浆皮质酮水平明显升高，一段时间后升高速度变缓，与本研究结果相似。并且在不同的应激模型中均能发现皮质酮水平的升高，如急性应激[14]、慢性社交失败应激模型[15]等，说明皮质酮在应激过程中发挥着重要作用。

行为学评价常用于评价PPD 动物模型，PPD的临床表现为焦虑、快感丧失甚至出现自杀倾向。在以往的研究中多以产后1 周为观察终点，但PPD 的病程时间可长达半年至1 年，因此本研究观察了雌鼠产后1 周和产后3 周两个时间点的行为学变化情况，并以产后3 周作为观察终点。行为学中旷场实验常被用来观察动物的紧张、焦虑情绪[16]，本研究发现在产后1 周模型组大鼠中心运动时长低于对照组，外周运动时长高于对照组，模型组的探索行为减少，产生焦虑、紧张情绪。蔗糖偏好实验用1%糖水消耗率来评价快感缺失程度，这一指标常常作为抑郁与否发生的标志[17]。快感缺失是PPD 的临床表现之一，CUMS大鼠与之出现了相同的情绪损伤。悬尾实验和强迫游泳实验以静止时间作为评价指标观察动物的绝望情绪。有研究[18]已证实CUMS 会使大鼠产生绝望情绪，且持续时间较长，与本研究结果相似。本研究显示，CUMS 会使产后大鼠产生焦虑、紧张、快感缺失、绝望等情绪，出现了与PPD 相似的临床表现。

神经内分泌因素与PPD 发病密切相关，而性腺轴（HPG）是女性分泌性激素的重要神经内分泌调节体系。妊娠期女性性激素水平的明显波动可引起情绪障碍，其机制主要与HPG 轴的反馈性调节有关。E2作为性激素的一种，其水平变化是目前较为公认的评价PPD 发生的指标。孕期E2水平波动较大，在孕晚期时可达到正常水平的40 倍，分娩后E2水平迅速下降[19]，导致产妇的情绪起伏大。有研究[20]表明PPD 患者的E2水平明显低于健康产妇。而CUMS 会导致产后E2水平降低[21]，进一步加剧抑郁样情绪的产生，能够很好地解释本研究结果。

从本研究中行为学实验及血清中E2变化情况可见，孕期慢性不可预知温和应激刺激可用来建立产后抑郁大鼠实验模型，进而可为后期从围产期出发研究产后抑郁发生原因及机制提供新方法。