LPAR1基因对脂多糖刺激下Ⅱ型肺泡上皮细胞中组织因子和纤溶酶原激活物抑制剂1表达的影响

刘颖 陈先俊 肖川 袁佳 李清 李璐 杨金凤 沈锋

贵州医科大学附属医院重症医学科 （贵阳 550004）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratorydistress syndrome，ARDS）是由多种肺内、外致病因素引起的急性呼吸衰竭综合征［1-2］，肺泡内大量纤维蛋白沉积是ARDS 重要的病理特征，其结果引起肺顺应性降低、肺弥散和换气功能受损等［3］，是引起ARDS顽固性低氧血症的重要机制［4］。研究［5-6］已证实，肺泡内促凝增强及纤溶过度抑制是引起肺泡纤维蛋白沉积的主要原因，但其发生机制不清楚。近年研究［7-8］发现，Ⅱ型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cell type Ⅱ，AECⅡ）对ARDS 肺泡内促凝和纤溶抑制具有重要调节作用。本课题组前期研究显示，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下，AECII 细胞分泌和表达组织因子（tissue factor，TF）及纤溶酶原激活抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）增加［9-13］，并由此对肺泡促凝及纤溶抑制进行调控。因此，我们使用该细胞作为本文的研究对象。

我们前期研究［14-17］发现，NF-κB 信号通路对TF 及PAI-1 的表达和分泌具有调节作用，但调节机制尚不清楚，因此，基于该信号通路，寻找相关的调节基因，对完善ARDS 肺泡内促凝增强及纤溶抑制的发生机制具有重要意义。我们对LPS损伤后的RLE-6TN 细胞进行RNA-seq 测序，通过生物信息分析，基于该信号通路找到了差异基因溶血磷脂酸受体1（lysophosphatidic acid receptor 1，LPAR1）。既往研究［18-22］证实抑制LPAR1 基因明显减轻了NF-κB 信号通路的活化，本课题组前期研究发现该信号通路对RLE-6TN 细胞中TF和PAI-1 的表达具有调控作用，推测LPAR1 通过影响NF-κB 信号通路进而对肺泡促凝增强及纤溶抑制进行调节。因此，本研究以大鼠AECⅡ细胞为研究对象，观察LPAR1 对LPS 刺激下AECⅡ细胞中TF 和PAI-1 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系 大鼠AECⅡ细胞株RLE-6TN 购自中南大学湘雅医学院细胞中心。实验过程中细胞处理措施符合医学伦理学标准，已取得贵州医科大学实验动物伦理委员会批准（编号：2304220）。

1.2 主要试剂 LPS（货号：L8880）购自Solarbio 公司。LPAR1（货号：ab23698）一抗购自美国Abcam公司；TF（货号：NBP2-67731）一抗购自美国NOVUS 公司；PAI-1（货号：66261-1-Ig）一抗购自Proteintech 中国公司；GAPDH（货号：AP0063）一抗及羊抗鼠二抗均购自巴傲得生物科技有限公司；山羊抗兔二抗购自Jackson 公司。慢病毒购于北京擎科生物有限公司，靶向干扰LPAR1 的shRNA序列为5'-GCTTCTACAACGAGTCTATCG-3'。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR Premix Ex Taq 购自TaKaRa 生物科技有限公司。

1.3 筛选关键差异基因 使用edgeR 进行标准化并计算两组样品间的倍数变化和p-value，筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。差异表达基因用P值和差异倍数（fold change，FC）的对数（logFC）表示，筛选标准为：P＜ 0.05 且|logFC| ＞ 1，使用ggplot2 R 包将相关基因绘制成火山图。进一步用clusterProfiler R 包对DEGs 做GO（GeneOntology）功能富集，富集分析的结果以P＜0.05 作为入选标准，从中找到NF-κB 通路相关的差异基因。使用R 软件heatmap R 包将差异基因绘制成基因热图，并进一步将通路和基因导入Cytoscape 3.8.2 软件构建通路与相关基因网络图，找到与非负调控NF-κB通路密切相关的上调基因。

1.4 细胞培养 将细胞置于25 cm2的培养瓶中，加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素溶液的DMEM 培养基，置于恒温细胞培养箱（37 ℃、5%CO2）中培养至对数期，用含0.25%的胰蛋白酶进行消化传代。

1.5 慢病毒转染 根据预实验MOI 加入病毒液进行感染，按照北京擎科生物公司提供的慢病毒使用手册，在感染慢病毒后的72 h，置于倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，后将细胞继续培养于含Puromycin（8 μg/mL）的培养液中进行筛选，得到稳转细胞株。

1.6 LPAR1 的动态表达及实验分组 用LPS 刺激处于生长对数期的RLE-6TN 细胞6、12、24、48及72 h，检测LPAR1 基因的动态表达水平，选取变化最明显的时间点作为研究时间。RLE-6TN 细胞转染LPAR1（sh-LPAR1）低表达慢病毒，空载慢病毒（sh-NC）作为对照。细胞分为对照组（PBS）、模型组（LPS）、模型+sh-LPAR1（LPS+sh-LPAR1）组和模型组+sh-NC（LPS+sh-NC）组。各组细胞分别加入PBS 和LPS 刺激24 h。

1.7 蛋白质免疫印迹实验（Western blotting，WB）检测LPAR1、TF、PAI-1 的蛋白表达 将给予处理的细胞放置于冰上裂解，收集裂解液离心后取上清液并使用BCA 试剂盒检测蛋白水平。按Western blotting 检测试剂盒操作说明检测蛋白表达量。

1.8 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-q PCR）检测LPAR1、TF、PAI-1的mRAN表达 使用TRIzol提取RLE-6TN的总RNA，并通过逆转录试剂盒合成c DNA，采用95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40 个循环的PCR 扩增，采用2-ΔΔCt法对数据进行量化。引物序列如下：LPAR1 正向：5'-ACTTCTTCGCTGGACTGG-3'，反向：5'-CTGTGATGTGCCTCT-CGAT-3'；TIFA 正向：5'-TGGACCTGCCTTACAAGT-G-3'，反向：5'-GTATGGGGCTCTGCGTT-3'；TF 正向：5'-ACTCAAGCACAGGAAAAAC-3'，反向：5'-TGGAGAAAATCACGGCTTGTAC-3'；PAI-1 正向：5'-GCCTGTTCCACAAGTCTGATG-3'，反向：5'-ATGAACATGCTGAGGGTTTTCG-3'；GAPDH 正向：5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'，反向：5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。

1.9 统计学方法 实验结果以3 次重复实验的均数±标准差表示。用GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB 信号通路相关的条目 对LPS 损伤后RLE-6TN 细胞进行RNA-seq 测序，与正常细胞比较，检测到差异表达基因531 个（P＜ 0.05），其中上调基因201 个，下调基因330 个，并绘制成火山图（图1）。进一步对531 个差异基因进行GO 功能富集分析，富集结果共16 个差异表达基因映射到4 个NF-κB 信号通路相关条目，且具有显著富集标准（P＜ 0.05，图1）。

图1 筛选NF-κB 信号通路相关的条目Fig.1 Screening for NF-κB signaling pathway-related entries

2.2 NF-κB 信号通路相关差异基因筛选 使用R软件，将上述16 个差异基因绘制热图（图2），同时我们将富集结果绘制成通路-基因靶点网络图（图2），找到LPAR1、TIFA（具有叉头相关结构域的肿瘤坏死因子受体相互作用蛋白）为上调且非负调控NF-κB 信号通路的差异基因。进一步我们通过预实验发现，LPS 刺激下RLE-6TN 细胞中LPAR1 表达升高（P＜ 0.05），而TIFA 的表达却减少（P＜ 0.05，图2），因此，本研究选择LPAR1 进行后续实验。

图2 NF-κB 信号通路相关差异基因的筛选Fig.2 Screening differential genes related to NF-κB signaling pathway

2.3 LPAR1 在LPS 刺激RLE-6TN 细胞中的动态变化 WB 和RT-q PCR 结果显示，LPS 处理6 h 后，LPAR1 mRNA 和蛋白表达开始升高，24 h 达到顶峰，之后逐渐降低（图3）。各时间点的表达均高于正常细胞LPAR1 表达水平（P＜ 0.05）。基于上述结果，我们选择LPS 刺激细胞24 h 进行后续相关实验。

图3 各组RLE-6TN 细胞中LPAR1 的表达Fig.3 Expression of LPAR1 in each group of RLE-6TN cells

2.4 转染慢病毒抑制LPAR1 的表达 RT-qPCR及WB 结果显示，与sh-NC 组相比，sh-LPAR1 组成功低敲了细胞中LPAR1 的表达（均P＜ 0.05）。NC组与sh-NC 组相比LPAR1 的表达差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

图4 低表达LPAR1 的慢病毒转染Fig.4 Lentiviral transfection with low expression of LPAR1

2.5 低表达LPAR1 对LPS 诱导下RLE-6TN 细胞中TF 表达的影响 LPS 刺激24 h 后，RLE-6TN 细胞中TF 的mRNA 和蛋白的表达水平与NC 组比较显著增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；低敲LPAR1 基因后，与sh-NC 组相比TF 的表达水平显著降低（P＜ 0.05），接近正常对照水平（图5）。

图5 各组RLE-6TN 细胞中TF 的表达Fig.5 Expression of TF in each group of RLE-6TN cells

2.6 低表达LPAR1 对LPS 诱导下RLE-6TN 细胞中PAI-1 表达的影响 LPS 刺激在RLE-6TN 细胞中引起PAI-1mRNA 和蛋白表达量升高（P＜ 0.05）；低敲LPAR1 基因后，与sh-NC 组相比PAI-1 的表达水平显著降低（均P＜ 0.05），接近正常对照水平（图6）。

图6 各组RLE-6TN 细胞中PAI-1 的表达Fig.6 Expression of PAI-1 in each group of RLE-6TN cells

3 讨论

AECⅡ是ARDS 发生发展过程中受损的主要靶细胞之一，对ARDS 肺泡促凝和纤溶抑制具有重要作用，因此我们选择该类细胞作为本文研究对象。在课题组前期研究中，我们发现以5 μg/mL的LPS 浓度刺激RLE-6TN 细胞，既未影响细胞活力，又能明显刺激TF、PAI-1 的表达［12］。因此，本实验仍采用5 μg/mL 的LPS 浓度刺激RLE-6TN 细胞，模拟革兰阴性杆菌诱导的ARDS 细胞损伤模型。

如前所述，肺泡促凝增强和纤溶过度抑制导致的肺泡内大量纤维蛋白沉积是ARDS 重要特征，在探讨其发生机制中，课题组研究结果证实，NF-κB 信号通路参与对肺泡内促凝增强及纤溶抑制的调节［14-15］，但调节机制不清楚。因此，我们对LPS 损伤后的RLE-6TN 细胞进行RNA-seq 测序，通过生物信息学分析，以NF-κB 为核心，找到上调且非负调控NF-κB 信号通路的差异基因LPAR1、TIFA，进一步通过RT-q PCR 进行验证，发现在LPS刺激下RLE-6TN 细胞中LPAR1 表达升高，而TIFA的表达却减少，因此我们对LPAR1 基因进行研究。通过LPS 处理RLE-6TN 细胞6、12、24、48、72 h 后，发现6 h 后LPAR1 mRNA 和蛋白表达开始升高，24 h 达到顶峰，之后逐渐降低，故我们选择LPS 刺激细胞24 h 进行实验。

观察LPAR1 对细胞中TF 和PAI-1 的调节作用是本文核心的研究内容。TF 和PAI-1 是引起ARDS 肺泡促凝增强和纤溶过度抑制的关键因子。TF 促使凝血酶原变成凝血酶，后者使纤维蛋白原变成纤维蛋白增加，同时PAI-1 抑制纤维蛋白的溶解，两者共同作用导致肺泡内纤维蛋白沉积增加［23-26］。本研究显示，LPS 刺激后，RLE-6TN细胞中TF、PAI-1 表达明显升高，与我们前期研究结果一致［11-13］。在此基础上，我们通过shRNA 技术调低了LPAR1 基因表达，结果显示低表达LPAR1显著降低了TF 和PAI-1 的转录和翻译水平，提示LPAR1 对LPS 刺激下TF 和PAI-1 表达具有调控作用。本文中，我们设置了慢病毒转染阴性对照组，结果显示该组TF 和PAI-1 水平与单纯LPS 组相仿，因此可以排除慢病毒本身对TF 和PAI-1 的影响。

鉴于我们前期已证实NF-κB 对TF 和PAI-1 的调节作用，结合本文发现LPAR1 对TF 和PAI-1 的影响，因此明确LPAR1 与NF-κB 信号通路之间的关系将对探讨ARDS 肺泡促凝增强和纤溶过度抑制的发生机制具有重要作用。既往研究［18-21］表明，LPAR1 对NF-κB 信号通路具有调节作用。本文中，通过RNA-seq 测序和GO 功能富集分析发现，LPAR1 与NF-κB 通路关系密切。推测LPAR1通过NF-κB 信号通路对LPS 刺激下RLE-6TN 细胞中TF 和PAI-1 表达进行调节。但两者到底通过怎样的相互作用方式对ARDS 肺泡促凝和纤溶抑制进行调节，本课题组将继续深入研究。

本实验存在的不足：（1）由于细胞实验与临床存在一定差异，本实验通过得出的结果不一定完全符合临床，因此还需要进一步临床研究证实。（2）本研究只低表达了LPAR1 基因，可进一步过表达LPAR1 进行验证。（3）LPAR1 基因是否通过NF-κB 信号通路来影响LPS 刺激下RLE-6TN 细胞中TF 和PAI-1 表达和分泌，需进一步验证。综上所述，LPAR1 基因对LPS 刺激下RLE-6TN 细胞TF和PAI-1 的表达具有调节作用。该基因有望成为纠正ARDS 肺泡内纤维蛋白沉积的的新靶标。

【Author contributions】LIU Ying performed the experiments and wrote the article.CHEN Xianjun，XIAO Chuan，YUAN Jia and LI Qing performed the experiments.LI Lu and YANG Jinfeng collected data.SHEN Feng designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.