BMI-1抑制剂PTC-596对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响

李玉玲 杨建林 崔芝 王静 吕亚丰 曹春雨

三峡大学基础医学院，肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室 （湖北宜昌 443002）

乳腺癌是全世界女性癌症相关第二大死亡原因，也是女性最常见的恶性肿瘤［1］。目前手术切除、放化疗、激素治疗和靶向治疗是最常见的乳腺癌临床治疗手段，虽然疾病治愈率有所提高，但晚期和转移性乳腺癌患者5 年生存期仍不足30%［2-3］，且手术和长期放、化疗的不良反应严重影响患者生存质量。因此，迫切需要寻找更加安全高效的靶向药物用于治疗乳腺癌。

原癌基因BMI-1（B-cell-specificmoloney murine leukemia virus insection site 1，BMI-1）是在小鼠淋巴瘤中被鉴定的原癌基因，属于多梳基因家族（polycombgroup genes，PcG）成员之一，广泛参与调控细胞增殖与分化［4］。已证实高表达BMI-1 不但与细胞恶性转化、肿瘤形成有关，而且与肿瘤细胞侵袭、迁移和转移复发密切相关，也是恶性肿瘤预后不良的病理指征［5-7］。因此BMI-1 成为癌症治疗有效新靶点［8-9］。目前研究［10］表明BMI-1 在乳腺癌组织中高表达，可作为乳腺癌治疗的关键靶向因素。PTC-596 是新近发现的特异性BMI-1 抑制剂，可通过诱导细胞凋亡对白血病、胶质瘤和淋巴瘤等发挥抗肿瘤效应［11-14］。但PTC-596 作为BMI-1抑制剂对乳腺癌治疗作用的研究目前尚未有报道，本研究探索PTC-596 对人乳腺癌MCF-7 细胞的杀伤作用及其可能的机制，以期为PTC-596 作为临床抗肿瘤新药和乳腺癌新型靶向药物治疗的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7 细胞购于中国科学院细胞库（上海），由肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室培养保存。PTC-596（荷兰Specs 生物特殊化合物公司）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美国Sigma公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国BI 公司）、青霉素/链霉素双抗（天津灏洋生物有限责任公司）；RIPA蛋白裂解液（武汉Servicebio 公司）；BIM-1 抗体、Bax 抗体、Bcl-2抗体、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抗体、Cyclin B1 抗体、Cyclin D抗体、P21 抗体、β-actin 抗体（武汉三鹰Proteintech公司）；ECL 超敏显影液（美国Thermo Scientific 公司）；BCA 蛋白定量试剂盒、FITC-Annexin V 凋亡检测试剂盒（南京Vazyme 公司）；ROS 活性氧检测试剂盒、JC-1 检测试剂盒（上海碧云天生物公司）。Western blot 电泳仪、电泳及转膜槽（美国Bio-Rad公司）；TE2000-S 荧光倒置显微镜（日本Nikon 公司）；FACSVerse 流式细胞仪（美国BD 公司）；全波长酶标仪（美国Thermo 公司）；ChemiScope mini 化学发光成像显影仪（上海勤翔公司）。

1.2 细胞培养、PTC-596 药物配置 用含10% 胎牛血清的DMED 培养基在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中传代培养MCF-7 细胞，待对数生长期时接种于细胞培养板。

PTC-596 干粉溶解于DMSO，配制终浓度为20 mmol/L 的药物母液，-20 ℃低温储存。实验中用DMEM 细胞培养液稀释至所需浓度。

1.3 CCK8法检测PTC-596对MCF-7细胞增殖的影响 取对数生长期MCF-7 细胞悬液接种于96 孔细胞培养板中（1.0 × 103个细胞/孔）继续培养48 h后，设无培养细胞的空孔为空白组，无PTC-596 的DMEM（含等量药物溶剂DMSO）培养为阴性对照组，和换终浓度分别为12.5、25、50、100、200 nmol/L PTC-596 的DMEM 细胞培养液的实验组，继续培养24、48、72 h 后，按照试剂盒说明书操作，加入CCK8试剂孵育1 h 后，酶标仪检测每孔450 nm 波长下的吸光度OD值。计算PTC-596 对MCF-7 细胞的生长抑制率：［1-（实验组OD值-空白组OD值）/（阴性对照组OD值-空白组OD值）］×100%。

1.4 细胞分组 以1.3 步骤实验结果为依据，PTC-596 处理48 h 后，对MCF-7 细胞的IC50值为（49.33 ± 7.02）nmol/L。后续研究分3 组，均培养48 h 后进行实验，以不含PTC-596 的DMEM 细胞培养液（含等量药物溶剂DMSO）培养组为阴性对照组，以分别含25、50 nmol/L 浓度PTC-596 的DMEM培养液培养组为低、高药物浓度实验组。

1.5 PI 单染/流式细胞术检测PTC-596 对MCF-7细胞周期影响 分别收集实验组和对照组MCF-7细胞，室温1 000 r/min 离心3 min 获得细胞沉淀，细胞用75%乙醇（1 × PBS配制）重悬后4 ℃固定过夜。PBS 洗涤细胞后，用含有0.1% TritonX-100、50 μg/L Rnase 和10 μg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）的PBS 染液于37 ℃避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 PI/FITC-Annexin V 双染/流式细胞术检测PTC-596 对MCF-7 细胞凋亡影响 分别收集实验组和对照组MCF-7 细胞，按照试剂盒说明书操作，样品细胞经FITC-Annexin V 和PI 避光染色15 min后，流式细胞仪检测凋亡细胞数量，以PI-/FITCAnnexin V+和PI+/FITC-Annexin V+为细胞凋亡判断标准。

1.7 DCFH-DA 探针/流式细胞术检测PTC-596 对MCF-7 细胞内活性氧水平影响 分别收集实验组和对照组MCF-7 细胞，按照试剂盒说明书操作，加入1 mL DCFH-DA 探针工作液于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，用无血清细胞培养液DMEM 重复洗涤细胞3 次，室温1 000 r/min 离心5 min 收集沉淀细胞，PBS 重悬细胞样品后，流式细胞仪检测DCF 荧光强度。DCFH-DA 为无荧光的小分子探针，可被细胞中的酯酶水解和活性氧氧化生成具有荧光的DCF，细胞内活性氧含量可依据DCF 荧光强度体现。

1.8 JC-1探针/流式细胞术检测PTC-596对MCF-7 细胞线粒体膜电位影响 分别收集实验组和对照组MCF-7 细胞，按照试剂盒说明书操作，加入JC-1染色工作液于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，用预冷的JC-1 染色缓冲液重复洗涤细胞3 次，4 ℃1 000 r/min 离心5 min 收集沉淀细胞，JC-1 染色缓冲液重悬后，流式细胞仪检测红、绿荧光强度。JC-1 是用于检测线粒体膜电位的荧光探针，细胞线粒体膜电位较高时，JC-1 在线粒体基质中聚集形成聚合物，发出红色荧光；当细胞线粒体膜电位降低，JC-1 呈单体形式存在，发出绿色荧光。线粒体去极化状态可依据红、绿荧光强度判断。

1.9 Western blot 检测PTC-596 对MCF-7 细胞BIM-1 蛋白、周期和凋亡相关蛋白表达影响 分别收集实验组和对照组MCF-7 细胞，加入RIPA 裂解液混匀后置于冰上30 min 裂解细胞，经过4 ℃、12 000 r/min 离心15 min 后，取上清用BCA 法测定其总蛋白浓度，分别将蛋白量为50 μg/样的上清液与上样缓冲液混合，100 ℃水浴加热10 min。所得各组样品蛋白依次经过SDS-PAGE 电泳分离，PVDF 膜转印，5%脱脂牛奶室温封闭，目的蛋白抗体4 ℃孵育过夜，和对应二抗室温结合2 h 后，ECL化学发光法显影并记录结果，灰度分析目的蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法 利用SPSS 22.0、Image-J 等软件对实验数据处理分析，实验数据用（±s）表示，实验数据两组间统计学差异比较采用t检验，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC-596抑制MCF-7细胞增殖 CCK8法检测结果显示PTC-596 具有高效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用（表1），且抑制效果随药物浓度增加和作用时间延长逐渐增强。计算PTC-596 处理MCF-7 细胞48 h 的IC50值为（49.33 ± 7.02）nmol/L。以此为依据，后续实验研究以PTC-596 终浓度分别为25、50 nmol/L 处理48 h 的MCF-7 细胞为实验组，以0 nmol/L PTC-596处理的细胞为对照组进行。

表1 PTC-596 抑制MCF-7 细胞增殖Tab.1 SI-4650 inhibited proliferation of SGC-7901 cells ±s，%

表1 PTC-596 抑制MCF-7 细胞增殖Tab.1 SI-4650 inhibited proliferation of SGC-7901 cells ±s，%

注：与对照组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

时间PTC-596 100 nmol/L 47.74 ± 4.04**77.11 ± 3.68**97.61 ± 1.59**0 nmol/L 0.00 ± 1.86 0.00 ± 2.95 0.00 ± 2.84 12.5 nmol/L 8.24 ± 3.72 24.57 ± 3.19**33.11 ± 3.21**24 h 48 h 72 h 25 nmol/L 22.84 ± 3.17**32.22 ± 3.63**47.97 ± 3.00**50 nmol/L 34.88 ± 2.63**55.22 ± 4.27**69.54 ± 2.18**

2.2 PTC-596 诱导人乳腺癌MCF-7 细胞发生G2/M 期周期阻滞 流式细胞术检测MCF-7 细胞周期结果显示，PTC-596 处理后，MCF-7 细胞G2/M 期细胞比例可高达83.31%，G0/G1期和S 期细胞比例从51.56%和32.92%同步减少至0.19%和15.5%。Western blot 法检测细胞周期相关蛋白表达结果显示，PTC-596 处理组细胞中Cyclin B1 与p21 表达从0.22、0.15上调至0.53和0.33，Cyclin D1表达从0.9 显著减少至0.64。与对照组相比，以上结果差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。提示PTC-596 可能通过干扰周期蛋白表达，抑制MCF-7 细胞分裂，将MCF-7 细胞阻滞在G2/M 期（表2，图1 ）。

图1 PTC-596 对MCF-7 细胞周期和周期相关蛋白表达的影响Fig.1 Effects of on cell cycle and the expressions of cell cycle related proteins in MCF-7 cells

表2 PTC-596 对MCF-7 细胞周期的影响Tab.2 Effect of PTC-596 on cell cycle of MCF-7 cells±s

表2 PTC-596 对MCF-7 细胞周期的影响Tab.2 Effect of PTC-596 on cell cycle of MCF-7 cells±s

注：与对照组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

PTC-596 0 nmol/L 25 nmol/L 50 nmol/L Cyclin B1/β-actin 0.22 ± 0.02 0.33 ± 0.02**0.53 ± 0.01**G0/G1（%）51.56 ± 2.52 53.21 ± 0.69 0.19 ± 3.28**S（%）32.92 ± 2.48 23.61 ± 2.05**15.50 ± 1.45**G2/M（%）15.42 ± 1.55 23.18 ± 1.56**83.31 ± 1.18**Cyclin D1/β-actin 0.90 ± 0.01 0.87 ± 0.05*0.64 ± 0.06**P21 /β-actin 0.15 ± 0.01 0.17 ± 0.01*0.33 ± 0.01**

表3 PTC-596 对MCF-7 细胞线粒体膜电位、活性氧、凋亡比例及凋亡相关蛋白的影响Tab.3 Effects of PTC-596 on mitochondrial function and apoptosis of MCF-7 cells±s

表3 PTC-596 对MCF-7 细胞线粒体膜电位、活性氧、凋亡比例及凋亡相关蛋白的影响Tab.3 Effects of PTC-596 on mitochondrial function and apoptosis of MCF-7 cells±s

注：与对照组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

PTC-596 0 nmol/L 25 nmol/L 50 nmol/L Apoptosis Ratio （%）2.04 ± 1.02 10.56 ± 1.97**26.74 ± 3.52**MMP（590 nm/530 nm）1.21 ± 0.21 0.73 ± 0.11**0.34 ± 0.17**ROS Concentration（480 nm）996 ± 257 1560 ± 191**2652 ± 266**Bcl-2/β-actin 0.48 ± 0.02 0.17 ± 0.01**0.12 ± 0.01**c-PARP/β-actin 0.09 ± 0.02 0.15 ± 0.01**0.34 ± 0.04**Bax/β-actin 0.30 ± 0.04 0.31 ± 0.01*0.55 ± 0.02**

2.3 PTC-596抑制MCF-7细胞BIM-1的表达 25、50 nmol/L PTC-596处理MCF-7细胞48 h后，Western blot 法检测对肿瘤细胞BMI-1 蛋白表达的抑制作用。与对照组相比，PTC-596 处理有效抑制MCF-7细胞中BMI-1 蛋白表达，呈浓度依赖性（图2）。提示PTC-596 高效抑制MCF-7 细胞中BMI-1 表达。

图2 PTC-596 对MCF-7 细胞BMI-1 蛋白表达的影响Fig.2 Effects of on the expressions of BMI-1 in MCF-7 cells

图3 PTC-596 对MCF-7 细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of on the apoptosis in human breast cancer MCF-7cells

图4 PTC-596 对MCF-7 细胞凋亡相关蛋白表达的影响Fig.4 Effects of on the expressions of apoptosis-related proteins in MCF-7 cells

2.4 PTC-596 诱导MCF-7 细胞发生凋亡 为探究PTC-596 高效抑制MCF-7 细胞增殖的机制，首先 PI/FITC-Annexin V 双染/流式细胞术检测结果显示，25、50 nmol/L PTC-596 分别处理MCF-7 细胞48 h 后，FITC-Annexin V（+）的凋亡细胞比例从2.04%增加至10.56%和26.74%，提示PTC-596 有效诱导MCF-7 细胞发生凋亡。进一步研究凋亡机制发现，实验组细胞中活性氧氧化产生的DCF 荧光强度随药物浓度的增加逐渐增高；单体JC-1的绿色荧光强度也随药物浓度的增加逐渐升高，红色荧光强度（聚合JC-I）/绿色荧光强度（单体JC-1）的比值随之逐渐减小，提示PTC-596 处理导致MCF-7 细胞活性氧增加，线粒体膜电位下降。Western blot 检测凋亡相关蛋白表达显示，实验组中凋亡降解蛋白c-PARP 和促凋亡蛋白Bax 相对表达分别从0.09 和0.30 增加至0.34 和0.55，凋亡抑制蛋白Bcl-2 相对表达从0.48 减少为0.12。以上结果与对照组相比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。提示PTC-596 诱导MCF-7 细胞凋亡，其机制可能与内源性线粒体依赖性的细胞凋亡相关。

3 讨论

乳腺癌因高发病率、易耐药和易转移性成为世界女性癌症相关第二大死亡原因。寻找新型高效安全的靶向药物对于晚期和转移性乳腺癌患者临床治疗是亟待解决的重要问题。研究表明，人乳腺癌组织中BMI-1 表达显著增加，促进肿瘤增殖和转移，敲除BMI-1 可有效逆转乳腺癌细胞上皮间质化，减少肿瘤干细胞，增加化疗药物敏感性，提示高表达的BMI-1 作为癌基因在乳腺癌发展过程中起促进作用，靶向BMI-1 可作为乳腺癌抗肿瘤药物研发新靶点［15-17］。PTC-596 是新近发现的靶向抑制BMI-1 的小分子化合物，已证实PTC-596 对高表达BMI-1 的套细胞淋巴瘤、急性髓系白血病干细胞、平滑肌肉瘤、胰腺导管腺癌和胶质母细胞瘤等多种恶性肿瘤有高效抑制作用，其机制与诱导肿瘤细胞发生非P53 依赖的线粒体途径细胞凋亡和有丝分裂阻滞等密切相关［18-21］。但目前尚未见PTC-596 对乳腺癌治疗作用的研究报道，本研究评估了PTC-596 抗人乳腺癌MCF-7 细胞增殖能力及可能的相关机制。

结果显示，MCF-7 细胞对PTC-596 高度敏感，nmol/L 级别浓度便可有效抑制BMI-1 表达和细胞增殖，且具有时间和浓度依赖性，提示PTC-596 作为广谱抗肿瘤药物，具备抗MCF-7 乳腺癌细胞的药理学活性。进一步探究了PTC-596 抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖的机制，在细胞增殖过程中，正常细胞周期进程至关重要，周期蛋白通过结合并激活细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）发挥调控细胞周期的作用［22-23］。如：CyclinD1/CDK4/6 驱动细胞周期开始、Cyclin B1/CDK1 启动有丝分裂进行、周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21 等共同协调发挥作用，保证细胞周期进程有序进行［24］。BMI-1 广泛参与细胞增值和分化过程，对细胞周期蛋白功能发挥起重要调控作用，在乳腺癌的发展过程中通过调节细胞周期蛋白D促进肿瘤细胞分裂增殖［17］。本研究显示，利用PTC-596 靶向性抑制MCF-7 细胞中BMI-1 蛋白表达后，MCF-7 细胞增殖抑制，同时出现周期蛋白CyclinD1 表达下降、Cyclin B1 和P21 表达增加，导致细胞有丝分裂停滞而被显著性阻滞在G2/M 细胞周期的现象。长时间的有丝分裂停滞可能导致细胞凋亡，因此本研究进一步检测了PTC-596 对MCF-7 细胞凋亡的影响。结果显示，PTC-596 处理MCF-7 细胞后，细胞中活性氧增加，可能引起线粒体受损膜通透性增加，从而表现出线粒体膜电位下降。同时促凋亡蛋白Bax 表达增高，抑制凋亡蛋白Bcl-2 表达减少，过量的Bax 形成寡聚物定位于线粒体膜，促使线粒体膜通透性转换孔开放，促使线粒体膜电位进一步下降，释放凋亡效应因子，激活Caspase 级联反应，活化的Caspase 3 剪切PARP 蛋白，引起c-PARP 增多，最终表现为凋亡细胞数量显著增加。以上结果提示，PTC-596 具有抗人乳腺癌MCF-7 细胞的药理学活性，其机制可能与抑制BMI-1 蛋白表达，干扰细胞正常周期进程与诱导线粒体途径的内源性细胞凋亡相关。此结果与以往学者对PTC-596 抗淋巴瘤、胶质瘤等机制相一致［25-26］，提示PTC-596 通过靶向抑制乳腺癌细胞BMI-1 表达发挥其抗肿瘤的活性。

综上所述，本研究显示PTC-596 可靶向性抑制人乳腺癌MCF-7 细胞中BMI-1 表达，发挥高效杀伤MCF-7 细胞的抗肿瘤活性，其机制可能与干扰细胞周期，阻滞细胞有丝分裂，诱导线粒体途径细胞凋亡相关。为BMI-1 作为人乳腺癌治疗的有效新靶点和PTC-596 抗乳腺癌临床药物使用提供了有效的理论依据。但本研究尚存在不足，仅在体外细胞水平探究了PTC-596 的抗乳腺癌细胞药理学活性，PTC-596 对MCF-7 细胞杀伤机制也未完全阐明，还需进一步探索。因此后续研究将首先通过动物体内实验进一步验证PTC-596 抗乳腺癌治疗的作用及相关机制。

【Author contributions】LI Yuling and YANG Jianlin performed the experiments and wrote the article.CUI Zhi and WANG Jing performed the experiments.LV Yafeng and CAO Chunyu revised the article.YANG Jianlin designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.