circ_0092315通过调控微小RNA-1256/高迁移率族蛋白A2促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭

柯淑红 孔彩霞 徐瑶 彭聪

摘要：目的 研究circ_0092315对甲状腺乳头状癌细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其分子机制。方法 采用实时荧光定量PCR方法检测人甲状腺乳头状癌细胞中circ_0092315的表达水平，CCK-8法和Transwell实验检测TPC-1细胞的增殖和侵袭能力，Western blot检测高迁移率族蛋白A2（HMGA2）蛋白表达水平。通过生物信息数据库、双荧光素酶报告基因检测、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法探讨circ_0092315、微小RNA-1256（miR-1256）和HMGA2的靶向调控关系。结果 circ_0092315在人甲状腺乳头状癌细胞中呈现高表达（P均＜0.001）。circ_0092315促进TPC-1细胞增殖和侵袭能力（P均＜0.001）。转染circ_0092315小干擾RNA可上调miR-1256的表达水平（P<0.001）。miR-1256抑制物上调HMGA2蛋白表达（P＜0.001）。结论 circ_0092315在人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中呈高表达，通过调控miR-1256/HMGA2轴促进TPC-1细胞的增殖和侵袭。

关键词：甲状腺乳头状癌；circ_0092315；微小RNA-1256；高迁移率族蛋白A2

中图分类号： R581.9  文献标志码： A  文章编号：1000-503X（2023）01-0016-06

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15026

circ_0092315 Promotes Proliferation and Invasion of Papillary Thyroid Carcinoma Cells via Regulating microRNA-1256/High Mobility Group A2 axis

KE Shuhong1，KONG Caixia1，XU Yao2，PENG Cong1

1Department of Endocrinology，2Department of Pathology，Wuhan No.1 Hospital，Wuhan 430030，China

Corresponding author：PENG Cong Tel：027-85332130，E-mail：343747430@qq.com

ABSTRACT：Objective To investigate the role and mechanism of circ_0092315 in the proliferation and invasion of papillary thyroid carcinoma cells.Methods The expression of circ_0092315 in papillary thyroid carcinoma cells was examined by real-time fluorescence quantitative PCR.The proliferation and invasion of TPC-1 cells was assessed by CCK-8 and Transwell assays.The protein level of high mobility group A2 （HMGA2） was determined by Western blotting.The regulatory relationship of circ_0092315，microRNA-1256 （miR-1256），and HMGA2 was explored by bioinformatics tools，dual-luciferase reporter assay，real-time fluorescence quantitative PCR，and Western blotting.Results circ_0092315 was overexpressed in papillary thyroid carcinoma cells （all P<0.001）.circ_0092315 promoted the proliferation and invasion of TPC-1 cells （all P<0.001）.The transfection of si-circ_0092315 up-regulated the expression of miR-1256 （P<0.001），and miR-1256 inhibitor up-regulated the protein level of HMGA2 （P<0.001）.Conclusion circ_0092315 is overexpressed in TPC-1 cells and it promotes the proliferation and invasion of TPC-1 cells by regulating the miR-1256/HMGA2 axis.

Key words：papillary thyroid carcinoma；circ_0092315；microRNA-1256；high mobility group A2

Acta Acad Med Sin，2023，45（1）：16-21

甲状腺癌是目前最常见的内分泌肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，占内分泌系统恶性肿瘤的95%［1］。甲状腺乳头状癌是甲状腺癌临床病理分型之一，也是最常见、分化程度高、恶性度小的甲状腺肿瘤［2］。尽管对其已有许多研究，但甲状腺乳头状癌的发生发展是一个涉及多因素的复杂生物学过程，目前具体发病机制不清。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类共价闭合环状的内源性非编码RNA，在正常生理活动以及各种疾病进程中具有重要作用［3］。研究表明circRNA在肿瘤中表达异常且与肿瘤的发生发展密切相关，但circRNA在甲状腺癌中的功能尚不清楚。最近研究发现，hsa_circ_0060060在甲状腺乳头状癌细胞中表达上调，并通过抑制微小RNA（microRNA，miR）-144-3p增加甲状腺癌细胞的顺铂耐药性［4］。本研究通过生物信息学方法研究circ_0092315对甲状腺癌乳头状癌细胞增殖和侵袭的影响，并探究其潜在的分子机制。

材料和方法

材料 人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1、人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1、BCPAP、IHH4购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。RPMI 1640培养基、胎牛血清購自美国Hyclone公司，TRIzol试剂盒、脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司，反转录和实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒购自日本Takara公司，circ_0092315小干扰RNA（si-circ_0092315）及小干扰RNA对照（si-对照）、miR-1256模拟物及模拟物对照、miR-1256抑制剂及抑制剂对照、空载质粒、过表达人高迁移率族蛋白A2（high mobility group A2，HMGA2）质粒购自上海吉玛制药技术有限公司，兔抗人HMGA2抗体（货号：ab207301）和GAPDH抗体购自美国Abcam公司，RIPA裂解液和BCA蛋白检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司。

细胞培养及转染 人甲状腺乳头状癌TPC-1、BCPAP、IHH4细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。取对数生长期的TPC-1细胞以1×105个/孔的密度接种于六孔板中，按照Lipofectamine TM 2000转染试剂盒说明书进行转染。根据处理情况将细胞分为si-circ_0092315组和si-对照组、miR-1256模拟物组和模拟物对照组、miR-1256抑制剂组及抑制剂对照组、si-circ_0092315+miR-1256抑制物组和si-circ_0092315+抑制物对照组、si-circ_0092315+过表达HMGA2组和si-circ_0092315+空载体组。

qRT-PCR检测 采用Trizol试剂按说明书提取细胞总RNA，通过反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。在ABI 7500定量PCR仪上完成qRT-PCR扩增，采用2-ΔΔCT法分别计算目标基因的相对表达量。引物序列：circ_0092315上游引物：5′-TGCCAGCATGTAGACCTCAG-3′，下游引物：5′-TTGTGAAAATGCCAAGGACA-3′；miR-1256上游引物：5′-GGCGCGATTTTAGTTTATC-3′，下游引物：5′-TTTAATTACCAACCGAATACG-3′；GAPDH上游引物：5′-GGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物：5′-CGGTGCCATGGAATTTGCC-3；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3′。circ_0092315基因检测以GAPDH作为内参，miR-1256基因检测以U6作为内参。

细胞增殖实验 将转染si-circ_0092315的TPC-1细胞以2×103个/孔的密度接种于96孔板中，分别培养24、48、72 h，每孔加入10 μl CCK-8试剂在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定各孔细胞在450 nm处的光密度（optical density，OD）值。

细胞侵袭实验 将10 μl Matrigel基质胶均匀涂在Transwell小室内面，待基质胶凝固。向24孔板中加入600 μl含有10%血清的DMEM高糖培养基，其内放置Transwell（8 μm）小室。向小室内加入转染si-circ_0092315或阴性对照的TPC-1细胞（2.5×104个/孔），置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。24 h后取出小室，用棉签将上室内面的细胞去掉，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%结晶紫染色液染色15 min，PBS清洗3次，用棉签擦净膜内面未迁移的细胞和染料，在显微镜下拍照，每个孔随机选5个视野拍照，并分别计数后求出平均值进行比较。

Western blot检测 按照每1.0×106个TPC-1细胞加入100 μl RIPA蛋白裂解液，混匀后置冰上30 min，4 ℃ 12 000 ×g离心30 min，取上清液，采用BCA法测定蛋白含量。将转有蛋白的PVDF膜置于5%脱脂奶粉室温中振荡封闭1 h，TBST缓冲液清洗后，加入兔抗人HMGA2抗体（1∶1000）4 ℃孵育过夜，清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，电化学发光法显色，凝胶成像系统扫描分析。

双荧光素酶报告基因检测 利用Circular RNA Interactome数据库（https：//circinteractome.nia.nih.gov/）预测circ_0092315靶基因。将circ_0092315的互补结合位点突变，构建突变型（circ_0092315突变型）和野生型（circ_0092315野生型）荧光素酶报告载体（广州锐博生物技术有限公司），并与miR-1256模拟物或模拟物阴性对照转染至TPC-1细胞中。转染24 h后，利用双荧光素酶活性检测试剂盒（Promega公司，美国）检测荧光素酶活性。

统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，并采用LSD检验进行两两比较；多组间不同时间点比较采用重复测量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结  果

人甲状腺乳头状癌细胞circ_0092315的表达水平 qRT-PCR检测结果显示，与人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1比较，人甲状腺乳头状癌TPC-1（3.152±0.053比0.989±0.007；t=104.977，P<0.001）、BCPAP（2.257±0.041比0.989±0.007；t=71.930，P<0.001）、IHH4细胞（1.859±0.059比0.989±0.007；t=37.323，P<0.001）中的circ_0092315表达水平显著升高，且在TPC-1细胞中表达最高（F=483.233，P<0.001）。

circ_0092315对TPC-1细胞增殖和侵袭能力的影响 与si-对照组比较，转染si-circ_0092315的TPC-1细胞中circ_0092315表达水平显著降低（0.486±0.046比0.990±0.009；t=30.982，P<0.001）。CCK-8法检测结果显示，si-circ_0092315组的TPC-1细胞在24、48、72 h的细胞增殖能力显著低于si-对照组（F=1896.298，P<0.001），且两组OD值变化趋势差异有统计学意义（F=1320.688，P<0.001）（图1A）。Transwell实验检测结果显示，si-circ_0092315组TPC-1细胞的侵袭能力显著低于si-对照组（37.000±5.121比94.100±4.012；t=27.756，P<0.001）（图1B）。

circ_0092315与miR-1256的关系 利用Circular RNA Interactome数据库分析发现，miR-1256和circ_0092315之间存在结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-1256模拟物和circ_0092315野生型共转染后，与模拟物对照组比较，miR-1256模拟物组荧光素酶活性显著降低（0.528±0.048比0.978±0.009；t=27.889，P<0.001）。与si-对照组比较，转染si-circ_0092315的TPC-1细胞miR-1256表达水平显著增加（2.126±0.063比0.986±0.011；t=51.347，P<0.001）。

si-circ_0092315和miR-1256抑制物对TPC-1细胞增殖和侵袭能力的影响 CCK-8法检测结果显示，si-circ_0092315+miR-1256抑制物组TPC-1细胞在24、48、72 h的细胞增殖能力显著高于si-circ_0092315+抑制物对照组（F=1690.251，P<0.001），si-对照+抑制物对照组、si-circ_0092315组、si-circ_0092315+抑制物对照组和si-circ_0092315+miR-1256抑制物组OD值变化趋势差异有统计学意义（F=598.694，P<0.001）（图2A）。Transwell实验检测结果显示，与si-对照+抑制物对照组比较，si-circ_0092315组TPC-1细胞迁移能力显著降低（21.100±7.838比98.400±1.265，t=30.789，P<0.001）；與si-circ_0092315组比较，si-circ_0092315+抑制物对照组TPC-1细胞迁移能力差异无统计学意义（21.000±2.449比21.100±7.838，t=0.039，P=0.970）；与si-circ_0092315+抑制物对照组比较，si-circ_0092315+miR-1256抑制物组TPC-1细胞迁移能力显著升高（55.400±3.098比21.000±2.449，t=27.542，P<0.001）（图2B）。

circ_0092315和miR-1256对HMGA2表达的影响 利用Targetscan数据库预测发现miR-1256与HMGA2之间存在结合位点（图3A）。Western blot检测结果显示，与模拟物对照组比较，miR-1256 模拟物组TPC-1细胞HMGA2蛋白表达水平显著降低（0.267±0.036比0.990±0.007；t=51.946，P<0.001）；与抑制物对照组比较，miR-1256抑制物组TPC-1细胞HMGA2蛋白表达水平显著升高（1.587±0.033比0.992±0.007；t=35.866，P<0.001）（图3B）。与si-对照组比较，si-circ_0092315组TPC-1细胞HMGA2表达下降（0.237±0.036比0.990±0.008，t=64.648，P<0.001）；与si-circ_0092315组比较，si-circ_0092315+抑制物对照组TPC-1细胞HMGA2表达差异无统计学意义（0.224±0.023比0.237±0.036，t=0.967，P=0.346）；与si-circ_0092315+抑制物对照组比较，si-circ_0092315+miR-1256抑制物组TPC-1细胞HMGA2表达显著增加（0.528±0.048比0.224±0.023，t=17.955，P<0.001） （图3C）。

过表达HMGA2和si-circ_0092315对TPC-1细胞增殖和侵袭能力的影响 CCK-8法检测结果显示，si-circ_0092315+过表达HMGA2组TPC-1细胞在24、48、72 h的细胞增殖能力显著高于si-circ_0092315+空载体组（F=3980.506，P<0.001），si-对照+空载体组、si-circ_0092315组、si-circ_0092315+空载体组、si-circ_0092315+过表达HMGA2组OD值变化趋势差异有统计学意义（F=1016.712，P<0.001）（图4A）。Transwell实验检测结果显示，与si-对照+空载体组比较，si-circ_0092315组TPC-1细胞侵袭能力显著下降（35.100±2.079比104.800±1.932，t=77.658，P<0.001）；与si-circ_0092315组比较，si-circ_0092315+空载体组TPC-1细胞侵袭能力差异无统计学意义（35.600±2.271比35.100±2.079，t=0.514，P=0.614）；与si-circ_0092315+空载体组比较，si-circ_0092315+过表达HMGA2组TPC-1细胞侵袭能力显著升高（82.200±4.614比35.600±2.271，t=28.656，P<0.001）（图4B）。

討  论

近年来越来越多的研究表明circRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。本研究结果发现circ_0092315在甲状腺乳头状癌细胞中呈高表达，且通过调控miR-1256/HMGA2通路促进TPC-1细胞的增殖和侵袭。

circRNA通过分子海绵作用结合miRNA从而调控蛋白表达发挥生物学作用。有文献报道circ_0087862可以竞争性结合miR-1253，通过调控Ras癌基因家族蛋白Rab3D的表达促进非小细胞肺癌的进展［6］；circ_0001955吸附miR-516a-5p上调肿瘤坏死因子受体相关因子6/丝裂原激活蛋白激酶11的表达促进肝癌细胞的增殖和迁移［7］。本研究通过生物信息方法预测circ_0092315靶基因，发现circ_0092315与miR-1256存在互补结合位点，干扰circ_0092315可上调miR-1256表达，抑制TPC-1细胞的增殖和侵袭能力。miR-1256已被证实在多种肿瘤中起到肿瘤抑制作用，其表达下调会促进肿瘤的生长和转移。Chang等［8］研究发现circ_0026134通过分子海绵机制下调miR-1256和miR-1287表达促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭；Cai等［9］研究显示circHECTD1通过靶向下调miR-1256表达激活β-连环蛋白/c-Myc信号通路促进胃癌的进展。因此，circRNAs可能通过负调控miR-1256的表达发挥促癌作用。

本研究通过Targetscan数据库分析发现HMGA2是miR-1256的靶基因，且miR-1256抑制HMGA2表达。HMGA2在多种恶性肿瘤中存在过表达现象，并通过多种机制促进肿瘤的发生［10］。Dong等［11］研究显示HMGA2参与驱动的FOXL2反式激活可直接调节对化疗耐药胃癌的转移和上皮间质转换。Ma等［12］研究表明miR-302a-5p/367-3p介导HMGA2表达可调控子宫内膜癌细胞的恶性表型。此外，近年来研究发现circRNA可通过调控HMGA2促进肿瘤进展，circ_100565通过miR-506-3p/HMGA2促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭［13］；circFAM73A调控miR-490-3p/HMGA2增强胃癌细胞干性［14］。本研究结果显示，过表达HMGA2可以逆转si-circ_0092315对TPC-1细胞增殖和侵袭能力的抑制作用，提示HMGA2参与circ_0092315对TPC-1细胞的促增殖和侵袭作用。

综上，本研究结果发现，circ_0092315在人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中呈高表达，通过内源竞争RNA机制调控miR-1256/HMGA2通路，促进TPC-1细胞的增殖和侵袭能力。但本研究缺乏体内实验的验证；此外，miR-1256/HMGA2下游的分子机制还有待进一步研究。

参 考 文 献

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（收稿日期：2022-04-01）