三七总皂苷注射剂除热原方法的效果及对有效成分的影响研究

杨妹妹 梁咏梅 招丽君 梁云飞 兰 星　

三七总皂苷注射剂除热原方法的效果及对有效成分的影响研究

杨妹妹1,2梁咏梅1,2招丽君1,2梁云飞1,2兰 星1,2

（1.广西梧州制药集团（股份）有限公司，广西 梧州 543002；2.广西三七综合利用技术重点实验室，广西 梧州 543002）

目的：考察三七总皂苷注射剂除热原方法的效果及其对三七总皂苷有效成分的影响。方法：外加细菌内毒素模拟热原污染，采用动态浊度法和高效液相色谱法检测药用炭吸附及无菌滤膜过滤前后三七总皂苷药液中细菌内毒素及有效成分含量，分别计算内毒素去除率和三七总皂苷回收率。结果：细菌内毒素标准曲线值为0.998 2，符合要求；三七总皂苷供试品最小无干扰稀释倍数为128倍；以水为溶质时，药用炭对细菌内毒素最小饱和吸附浓度为0.1%；以三七总皂苷为溶质时，细菌内毒素最小饱和吸附浓度为0.5%；药用炭吸附后再通过过滤手段能进一步提高细菌内毒素去除率；药用炭对不同浓度的药液存在不同吸附影响。结论：同时采取药用炭吸附与过滤两种手段能有效除去细菌内毒素，但对于突发大污染情况，常规药用炭用量可能不能完全控制细菌内毒素的清除。

三七总皂苷；动态浊度法；细菌内毒素；药用炭

引言

热原反应是注射剂给药过程中常见的安全性问题之一[1-3]，由热原引起的不良反应事件被多次报道，如2009年的香丹注射液、2015年的生脉注射液、2017年的红花注射液[4]。因此对于注射剂生产全过程热原的控制尤为重要，而在生产过程中溶剂的贮存、使用，原辅料、配制注射剂的装置、用具、容器等均有可能带入热原[5]。国家食品药品监督管理局对生产过程除热原的方法及效果作出了明确的要求[6]。三七总皂苷注射剂生产过程以药用炭吸附和过滤为主要的除热原手段，其中饱和吸附又是药用炭除热原效果的影响因素之一[7,8]。本研究采用外加细菌内毒素模拟中药注射剂热原污染，以动态浊度法检测药用炭吸附及过滤前后药液中细菌内毒素含量，考察热原去除效果，检测三七总皂苷含量变化，探讨药用炭对三七总皂苷有效成分的影响，为三七总皂苷注射剂的生产工艺中去除热原方法提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BET-48G细菌内毒素检测仪（厂家：天津市天大天发科技有限公司，仪器型号：BET-48G）；电子天平[厂家：丹佛仪器（北京）有限公司，仪器型号：TP-214]；超声波清洗机（厂家：宁波新芝生物科技股份有限公司，仪器型号：SB-5200-DTD）；ZH-3自动旋涡混合器（厂家：天津药典标准仪器厂，仪器型号：ZH-3）；Thermo高效液相色谱仪（厂家：赛默飞世尔科技（中国）有限公司，仪器型号：Uitimate 3000）；电子分析天平（厂家：METTLER TOLEDO，仪器型号：MS204S）。

1.2 材料

三七总皂苷（PNS，广西梧州制药集团股份有限公司，批号：190202-2、190203-2、190301）；三七总皂苷对照（中国食品药品检定研究院，批号：110870-201904，规格：100 mg/支）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号：150601-202088，效价：60 EU/支）；细菌内毒素检查用水（中国食品药品检定研究院，批号：160006-201805，规格：10×5 mL）；动态浊度鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号：2009041、2010140）；动态浊度法鲎试剂（厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号：20104121，规格：1.7 mL/支）；甲醇（北京迪科马科技有限公司；批号：R141823，色谱纯）；乙腈（北京迪科马科技有限公司，批号：R141792，色谱纯）；药用炭（上海兴长活性炭有限公司，批号：Q251a2008020）；无热原安瓿（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1912020，规格：2 mL/支）；无热原安瓿（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1912250，规格：5 mL/支）；无热原吸头（湛江安度斯生物有限公司，批号：2005021，规格：1 000 µL）；无热原吸头（湛江安度斯生物有限公司，批号：2004211，规格：250 µL）；无菌一次性过滤装置（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号：1258276，规格：0.45 µm）；无菌一次性过滤装置[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号：1267078，规格：0.2 µm]；水（Millipore）。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的可靠性试验

用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品进行稀释，分别配制成2、0.5、0.125、0.031 25 EU/mL的系列标准品溶液。取系列标准品溶液各0.1 mL加入预先添加0.1 mL鲎试剂的反应管内，每个浓度2个平行管，同时设置检查用水为阴性对照，反应管放入细菌内毒素检测仪中进行检测。以细菌内毒素浓度为横坐标，反应时间的对数为纵坐标，得回归方程：LgT=2.88 716-0.318 51 LgC，=-0.998 2，阴性对照反应时间大于标准曲线最低点的反应时间，∣∣大于0.98，变异系数CV小于10%，标准曲线成立，表明线性关系良好。结果见表1。

表1 动态浊度法标准曲线的可靠性试验结果（n=2）

注“/”表示无对应值。

2.2 干扰试验

2.2.1 不同批次三七总皂苷干扰试验

取三七总皂苷适量，加纯化水溶解使成为浓度150 mg/mL的母液。根据最大稀释倍数，取母液分别稀释32、64、128、256、512倍，使成为浓度分别为4.687 5、2.343 75、1.171 875、0.585 937 5、0.292 9 mg/mL的系列溶液A三七总皂苷，平行配制三批系列溶液A三七总皂苷。每个浓度的三七总皂苷稀释液加入细菌内毒素工作标准品，制成含0.25 EU/mL细菌内毒素的供试品阳性系列溶液B。动态浊度法检测系列溶液A三七总皂苷、溶液B细菌内毒素浓度，计算3个不同批次三七总皂苷供试品在相应稀释倍数下的细菌内毒素回收率。当稀释倍数在128～512倍范围内，内毒素回收率在50%～200%之间，表明该试验浓度条件下供试品溶液不存在干扰作用，三七总皂苷供试品最小不干扰稀释倍数为128倍。结果见表2。

表2 不同批次三七总皂苷细菌内毒素干扰试验结果

2.2.2 不同厂家鲎试剂干扰试验

随机取三七总皂苷一批按照“2.2.1”项下溶液制备方法制备系列溶液A三七总皂苷、溶液B。取系列溶液A三七总皂苷、溶液B使用两个不同生产厂家鲎试剂进行干扰试验，计算系列溶液细菌内毒素回收率。使用两个不同厂家生产的鲎试剂进行干扰试验，三七总皂苷样品（150 mg/mL）在稀释倍数128～512倍范围内的试验浓度条件下检测内毒素回收率均在50%～200%之间，则在此实验条件下均不存在干扰作用，最小不干扰稀释倍数为128倍，表明两个不同生产厂家检测结果相比无明显差别。结果见表3。

表3 不同厂家鲎试剂干扰试验结果

2.3 药用炭对细菌内毒素饱和吸附试验

配制含细菌内毒素浓度为0.25 EU/mL的100 mL水溶液4份，在4份溶液中分别加入4种浓度为0.05%、0.1%、0.5%、1.0%的药用炭，60℃～65℃搅拌吸附30 min，经0.45 µm无菌一次性过滤装置过滤得到药用炭吸附后的滤液，动态浊度法分别测定各滤液中细菌内毒素的含量。结果显示，当药用炭浓度为0.05%时，吸附后水溶液中内毒素含量明显降低，从初始0.25 EU/mL降至0.098 2 EU/mL，除菌率为60.72%；当药用炭浓度增至0.1%及以上时，内毒素则完全被除去，说明药用炭能够通过吸附作用有效去除水溶液中的细菌内毒素，且内毒素去除率与药用炭浓度呈正相关，最少使用量为0.1%。结果见表4。

表4 药用炭对细菌内毒素饱和吸附试验结果

注“/”表示无对应值。

2.4 药用炭对三七总皂苷吸附影响试验

2.4.1高效液相色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进样量10 µL，按下表进行梯度洗脱；检测波长为203 nm。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于8 000。

表5 流动相梯度表

2.4.2对照品溶液的制备

取三七总皂苷对照提取物适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含2.5mg的溶液，即得。

2.4.3供试品溶液的制备

模拟三七总皂苷注射剂生产工艺，精密称取三七总皂苷粉末适量，溶解配制成浓度为125 mg/mL的三七总皂苷药液4份各100 mL，分别加入0.05%、0.1%、0.5%、1.0% 4种浓度药用炭，搅拌吸附，经0.45 µm无菌一次性过滤装置过滤得药用炭吸附后药液，分别取药用炭吸附前后药液各0.32 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，即得供试品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件检测并计算吸附前后三七总皂苷中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd总含量，计算回收率。结果显示，药用炭吸附前后药液三七总皂苷含量的回收率在100%～102%范围内，三七总皂苷含量随着药用炭的增加无明显变化，表明药用炭在0.05%～1%范围内对高浓度三七总皂苷溶液（125 mg/mL）几乎无吸附影响。结果见表6。

表6 药用炭吸附前后三七总皂苷含量及回收率结果

2.5 药用炭和过滤对细菌内毒素污染的三七总皂苷吸附试验

根据干扰实验，最小不干扰稀释倍数为128倍，即三七总皂苷浓度为1.171 9 mg/mL，为避免浓药液对细菌内毒素检测的干扰，因此该试验中三七总皂苷供试品溶液浓度选择1.171 9 mg/mL。

称取三七总皂苷粉末适量，溶解配制成浓度为1.171 9 mg/mL的药液4份，各100 mL，分别外加细菌内毒素工作标准品，得三七总皂苷原液。每份原液加入0.05%、0.1%、0.5%、1.0% 4种浓度药用炭，搅拌吸附得三七总皂苷吸附液，将吸附液用0.2 μm无菌一次性过滤装置过滤，得过滤液。分别计算吸附液、过滤液的细菌内毒素去除率及三七总皂苷含量的回收率。结果显示：随着药用炭浓度（0.05%～1%）的增加三七总皂苷药液回收率逐渐减小（96.56%→9.2%），药用炭浓度小于或等于0.1%时，三七总皂苷回收率大于90%，当药用炭浓度大于或等于0.5%时，三七总皂苷损失大于50%，药用炭对低浓度三七总皂苷（1.171 9 mg/mL）吸附影响较大；吸附液过滤后，细菌内毒素含量进一步降低，药用炭含量为0.1%及以上时，除菌率大于90%。结果见表7、表8。

表7 三七总皂苷含量及回收率结果

表8 细菌内毒素含量及去除率结果

注“/”表示无对应值。

3 结论

（1）一般注射剂常用药用炭及过滤除菌作为热原去除手段，从药用炭对细菌内毒素饱和吸附实验结果看，完全吸附除去细菌内毒素的最小药用炭浓度为0.1%，笔者模拟三七总皂苷药液外源性突发污染情况，0.1%药用炭除菌率却只有83.49%，当药用炭使用量达到0.5%时，细菌内毒素去除率才能达到100%，假如三七总皂苷药液在生产过程发生突发污染情况，单纯使用常规用量药用炭可能达不到对细菌内毒素的除菌效果。

（2）将药用炭吸附液通过0.2 μm微孔滤膜装置过滤，过滤液中三七总皂苷的含量与吸附液相比无差别，表明过滤步骤对三七总皂苷溶液浓度无显著影响，而过滤液的细菌内毒素含量较吸附液时有下降，提示过滤除菌手段能进一步提高除菌率。

（3）三七总皂苷注射剂在生产过程采用药用炭与过滤手段除去细菌内毒素，但对于大剂量的细菌内毒素，常规方法的除去效果并不能达到100%，需要对工艺风险进行合理评估，保证最终产品的临床安全性。

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Study on the Effect of Depyrogenation Method of Panax Notoginsenosides Injection and Its Influence on Active Ingredients

Objective: To investigate the effect of depyrogenation method of Panax notoginsenosides injection and its influence on active ingredient of Panax notoginsenosides. Methods: The bacterial endotoxin was added to simulate pyrogen pollution, and the content of bacterial endotoxin and active ingredient in Panax notoginsenosides solution before and after medicinal charcoal adsorption and sterile membrane filtration were detected by dynamic turbidimetry and high-performance liquid chromatography. The endotoxin removal rate and recovery rate of Panax notoginsenosides were calculated respectively. Results: Thevalue of the bacterial endotoxin standard curve is 0.9982, which meets the requirements; the minimum non-interference dilution ratio of Panax notoginsenosides for the test sample is 128 times; when water is used as the solute, the minimum saturated adsorption concentration of bacterial endotoxins on medicinal charcoal is 0.1%; when using Panax notoginsenosides as solute, the minimum saturated adsorption concentration of bacterial endotoxin is 0.5%; the adsorption of medicinal charcoal and subsequent filtration can further improve the removal rate of bacterial endotoxins; medicinal charcoal has different adsorption effects on different concentrations of medicinal solutions. Conclusion: Both medical carbon adsorption and membrane filtration can effectively remove bacterial endotoxins, but for sudden large pollution situations, conventional dosage of medicinal charcoal may not fully control the clearance of bacterial endotoxins.

Panax notoginsenosides; dynamic turbidity method; bacterial endotoxin; medicinal charcoal

R282

A

1008-1151(2023)09-0026-04

2023-04-27

中央引导地方科技发展资金项目（桂科ZY22096004）；广西科技基地和人才专项（桂科AD20297068）；梧州市科技计划项目（202202022）。

杨妹妹（1993－），女，广西梧州制药集团（股份）有限公司助理工程师，研究方向为药品生产工艺和质量标准研究。

梁咏梅（1994－），女，广西梧州制药集团（股份）有限公司助理工程师，研究方向为药品生产工艺和质量标准研究。