水热预处理对餐厨垃圾厌氧发酵产戊酸的影响

王雪婷，顾霞，徐先宝，赵磊，薛罡，李响

（1 东华大学环境科学与工程学院，上海 201620；2 维尔利环保科技集团股份有限公司，江苏 常州 213125）

戊酸是含有五个碳原子的饱和脂肪酸[1]，已广泛应用于化工、制药、食品、饮料和纺织等行业[2]，可用于生产防腐剂、稀释剂、药物、增塑剂、香料、纤维、添加剂以及可生物降解塑料聚羟基烷酸酯[3-4]。目前，戊酸生产主要依赖于石油化工以及化学合成[5]，然而化工合成能耗大、成本高且会产生环境污染，因此，拓展绿色的戊酸生产方式具有广阔的前景和意义。

近年来，利用碳链延长方法将有机废弃物转化为有机酸[6]的方式越来越受到研究者的关注。碳链延长技术是特定的碳链延长微生物利用乙醇、乳酸等能源物质作为电子供体，以乙酸、丙酸等短链羧酸作为电子受体[7]，在生物酶的催化作用下，通过反向β 氧化循环反应将短链羧酸进行碳链延长[8]。早期利用碳链延长方法产戊酸的研究多集中于纯底物和纯菌，Grootscholten 等[9]和Ganigué 等[10]在纯底物体系投加外源乙醇并接种克氏梭菌（Clostridium kluyveri）生产戊酸，最终戊酸的产量分别可达10.61g COD/L 和10.81g COD/L。但是纯菌体系操作烦琐，耐冲击负荷能力弱，且运行成本高，不利于工业化的大规模生产[11]。因此研究者尝试利用混菌体系生产戊酸，餐厨垃圾因其有机质丰富成为研究中常用的底物。在前期的研究中选取了两种常用的菌源（剩余污泥和酒曲），结果表明在接种剩余污泥的发酵体系中戊酸产量为5.01g COD/L，而接种酒曲的发酵体系中戊酸产量仅为2.83g COD/L[12]，混菌体系戊酸的产量远低于纯菌体系。此外，分析得知，酒曲体系中产生了高浓度的乙醇，而研究证实醇酸比高时易产生高浓度的己酸和庚酸，醇酸比低时易产生大量戊酸[13]，因此调控乙醇的产量有利于提高发酵体系中戊酸的产量。

Taherzadeh 等[14]和Taue 等[15]的研究发现呋喃、糠醛和羟甲基糠醛会降低发酵体系中乙醇的生成，可使乙醇的产量降低80%，而餐厨垃圾水热预处理过程中会发生美拉德反应，产生类黑精类物质、呋喃、糠醛和胺类物质等[16]。因此利用水热法预处理餐厨垃圾抑制乙醇的产量，从而提高戊酸的产量是一种可行的方法，然而尚缺乏水热预处理对餐厨垃圾厌氧发酵产戊酸的效果验证。

本文基于前期的研究基础[12]，选取了戊酸产量高的剩余污泥体系和戊酸产量低的酒曲体系作为菌源，以批次发酵的方式，研究了在不同水热预处理温度下，餐厨垃圾厌氧发酵产戊酸的效能，探究了产酸代谢机制，同时研究了微生物群落组成变化，为餐厨垃圾高值资源化提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 实验材料

餐厨垃圾，东华大学食堂，以蔬菜、米饭和肉为主，挥发性固体（VS）值为0.38g/g，经手工筛选和搅拌机搅碎后放置在4℃的冰箱内保存备用；剩余污泥，上海市某污水处理厂，VS 值为11.10g/g，室温下保存备用；酒曲，上海市某酒厂，VS值为0.78g/g，经搅拌机混匀放置在4℃的冰箱内保存备用。

1.2 实验装置与方法

发酵罐运行之前，将餐厨垃圾分别在80℃、100℃、120℃、140℃、160℃、180℃条件下进行水热预处理，随后将不同水热预处理温度下得到的发酵底物分成两组：其中一组接种酒曲（DY-B、DY-80、DY-100、DY-120、DY-140、DY-160、DY-180）；另一组接种剩余污泥（WAS-B、WAS-80、WAS-100、WAS-120、WAS-140、WAS-160、WAS-180）。发酵罐有效容积为200mL，底物浓度为(42.0±0.5)g VS/L（餐厨垃圾∶菌源=6∶1），投加20g/L 的CaCO3缓冲pH。将厌氧发酵罐置于磁力搅拌器上，放置于37℃恒温箱内。

发酵周期为20天，每隔2天进行一次取样，将5mL 发酵液置于离心管中经8000r/min 离心10min。取上层清液经0.45µm 滤膜过滤后，用于分析发酵体系中的戊酸、乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、己酸和庚酸的变化情况；下层固体物质标记后置于-20℃的冰箱中保存，用于体系中微生物的分析。

1.3 组分分析方法

挥发性固体量采用马弗炉重量法测定；戊酸、乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、己酸和庚酸的测定采用气相色谱仪GCSmart（GC-2018）测定，检测器类型为FID 检测器，检测器温度设为250℃，进样口温度设为220℃，载气为N2，载气流速设为50mL/min，测定时间为15min，利用外标法进行定量；餐厨垃圾水热预处理后溶解性有机物的测定采用荧光光度计（Hitachi F-7000）进行扫描测定，利用Matlab软件对扫描结果进行分析。

1.4 微生物测序方法

选择发酵12天时的DY-B、DY-100、DY-140、DY-180 和 WAS-B、 WAS-100、 WAS-140、WAS-180的8个样品进行微生物群落分析。微生物群落样品选择高通量测序技术进行分析，测样公司为上海派森诺生物科技有限公司，PCR 扩增引物序列为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'），扩增区域为V3～V4区，测序平台为Illumina Miseq。

2 结果与讨论

2.1 水热预处理对餐厨垃圾发酵产戊酸的影响

由图1(a)结果可知，接种酒曲体系下，空白组戊酸最大产量为3.47g COD/L，水热预处理后，戊酸最大浓度分别提升至13.03g COD/L （80℃）、12.05g COD/L （100℃）、12.68g COD/L （120℃）、14.81g COD/L（140℃）、12.67g COD/L（160℃）和16.19g COD/L（180℃）。结果表明，水热预处理显著提高了酒曲体系中戊酸的产量，其中DY-180组戊酸产量与DY-B 相比提高了3.66 倍。由图1(b)结果可知，接种剩余污泥体系下，空白组戊酸最大产量为10.64g COD/L，高于接种酒曲的空白组，与郭志超等[12]的研究结果一致。水热预处理后，戊酸最大浓度提升至12.57g COD/L（80℃）、12.73g COD/L（100℃）、12.63g COD/L （120℃）、13.11g COD/L（140℃）、15.75g COD/L（160℃）和18.55g COD/L（180℃）。结果表明，水热预处理同样提高了剩余污泥体系中戊酸产量，WAS-180 组戊酸产量与WAS-B 组相比提高了0.74 倍。研究表明，以粗甘油为底物时戊酸的产量仅为6.9g COD/L[17]；以剩余污泥为底物时戊酸的产量仅为2.82g COD/L[2]。本文以成分复杂的餐厨垃圾作为发酵底物，并利用水热预处理的方法显著提高了体系中戊酸的产量，最高产量可达18.55g COD/L。

图1 不同水热预处理发酵体系下戊酸的产量

2.2 水热预处理对餐厨垃圾发酵产有机酸及乙醇的影响

2.2.1 水热预处理对戊酸代谢过程的影响

戊酸的产生和消耗主要是通过反向β 氧化途径，微生物利用体系中乙醇作为电子供体，丙酸作为电子受体通过一次反向β循环产生戊酸，同时戊酸也可作为电子受体与乙醇通过反向β循环产生庚酸[18]，因此关注发酵体系内丙酸和庚酸的变化对戊酸的产生和积累尤其重要。如图2所示，在酒曲体系中，空白组丙酸的最大产量是2.16g COD/L，水热预处理组丙酸的最大产量可达到10.58g COD/L（180℃）；在剩余污泥体系中，空白组丙酸的最大产量是12.10g COD/L，水热预处理组丙酸的最大产量可达到14.63g COD/L（120℃）。结果表明，水热预处理后接种酒曲及污泥体系中的丙酸产量均有显著提高。研究发现，腐殖酸可以提高水解酶的活性，增强电子转移效率，促进发酵体系产短链羧酸[19]。如图3 所示，随着水热预处理温度的提高，餐厨垃圾中腐殖酸的比例逐渐增加，体系中丙酸浓度的提高可能与腐殖酸浓度的增加有关。同时研究发现，水热预处理会提高体系中乳酸的产量，部分乳酸会通过丙烯酸途径转化为丙酸，实现了体系中丙酸的积累[20]。丙酸与乙醇氧化形成的乙酰辅酶A缩合形成戊酸，因此经水热预处理后的酒曲体系和剩余污泥体系中戊酸的产量会增加，该过程的反应方程式见式(1)、式(2)、式(4)、式(5)[21]。在戊酸的消耗方面，随着发酵时间的延长，在电子供体充足的情况下，戊酸会作为电子受体通过一次反向β循环生成庚酸，该过程的反应方程式见式(6)[21]。酒曲和剩余污泥体系中，空白组中庚酸的产量可分别达到1.84g COD/L 和2.33g COD/L，经水热预处理后体系中庚酸的产量均下降，其中最低产量分别为0g COD/L（DY-120）和0.71g COD/L（WAS-160），水热预处理减少了戊酸的消耗，实现了戊酸的积累。

图2 不同水热预处理发酵体系下有机酸的变化

水热预处理对乙酸、丁酸和己酸的产量如图2所示，在酒曲和剩余污泥体系中，水热预处理后乙酸产量与空白组相比均有提高，而水热预处理后丁酸和己酸的产量与空白组相比显著下降。研究发现水热预处理会产生类黑精类物质（类腐殖酸区），而类黑精类物质会抑制发酵过程中乙酸向丁酸的转化[22]，因此水热预处理组乙酸产量会有明显的积累，该过程的反应方程式见式(3)和式(7)[21]。体系中己酸产量的降低可能与电子受体丁酸不足，微生物无法利用乙醇进行碳链延长反应有关，该过程的反应方程式见式(8)[21]。丁酸和己酸浓度的降低减少了碳链延长过程中乙醇的消耗，为生产戊酸积累了充足的电子供体。

2.2.2 水热预处理对产乙醇的影响

乙醇是富含能量的还原性物质，为碳链延长提供能量，可氧化产生乙酰辅酶A[23]进而发生缩合反应促进碳链延长反应，是产戊酸的重要电子供体。低浓度的乙醇会导致碳链延长不充分，而乙醇浓度过高会对微生物有毒害作用[24]。如图4所示，在酒曲和剩余污泥体系中，空白组乙醇浓度最高可分别达到14.90g COD/L 和3.96g COD/L，水热预处理组乙醇浓度与空白组相比有明显的下降，这与空白组产生高浓度的中长链羧酸（己酸和庚酸）而水热预处理组产生高浓度的戊酸现象一致。

研究表明，醇酸比对发酵体系中有机酸的组成和产量有重要影响[25]，醇酸比高时易产生高浓度的己酸和庚酸，醇酸比低时易产生大量戊酸[13]。乙醇和丙酸可以通过一次反向β循环产生戊酸，本研究中乙醇/丙酸的值如表1 所示，空白组醇酸比分别为6.48（酒曲体系）和1.55（剩余污泥体系），水热预处理后醇酸比与空白组相比有明显的下降。在酒曲体系中，DY-B（6.48）和DY-80（4.66）醇酸比高，这与体系中高浓度己酸和庚酸现象一致，而DY-100、DY-140、DY-160 和DY-180 的醇酸比均处于较低水平（0.14～1.30），因此产生了高浓度的戊酸。在剩余污泥体系中，所有反应罐中醇酸比均处于较低水平（0.40～1.55），故剩余污泥组戊酸的产量高。上述现象与苑荣雪[26]研究的醇酸比对厌氧发酵中产有机酸的影响一致，醇酸比为3时主要以产己酸和庚酸为主，而醇酸比为1 和0.5 时，戊酸的产量与高醇酸比组相比有显著升高。另外，如图5所示，在酒曲和剩余污泥体系中，戊酸产量较高的两组（DY-180和WAS-180）发酵前期（2～8 天），乙醇、乙酸、丙酸和丁酸的浓度均呈现上升趋势，醇酸比较高，电子受体乙酸易与电子供体乙醇反应产生丁酸，消耗了电子供体乙醇，此阶段戊酸的产量缓慢增长。在发酵第8～12 天，随着戊酸产量的快速提高，乙醇和丙酸分别作为电子供体和电子受体被消耗，浓度呈快速下降趋势。当戊酸的产量达到峰值时，此时乙醇浓度突然降为0。在发酵后期第16～20天时，戊酸、丁酸、己酸和庚酸的产量保持不变，这可能与体系中缺乏电子供体乙醇有关。水热预处理可以降低发酵体系中乙醇的浓度，调控醇酸比，促进餐厨垃圾厌氧发酵体系中戊酸的产生和积累。

表1 不同发酵时间下各样品的乙醇/丙酸值

图5 180℃时不同菌源发酵体系下物质的产量

2.3 微生物群落结构分析

戊酸的产生与电子供体乙醇密切相关，在发酵的第12 天，接种酒曲和剩余污泥的体系中乙醇的浓度大部分均下降至0，因此选取了发酵第12天时的样品进行Alpha 多样性分析和微生物群落结构分析。

2.3.1 Alpha多样性分析

各发酵罐的Chao1、Shannon 和Simpson 指数如表2所示，在酒曲体系中，原始酒曲的微生物群落单一[12]，水热预处理后细菌群落Chao1、Shannon和Simpson 指数与空白组相比有明显的提高，说明水热预处理后微生物群落丰富度和多样性更高，群落结构趋于复杂，丰富了参与溶出、水解和产戊酸的功能菌群，水热预处理组戊酸产量的增加可能与产戊酸功能菌群的丰度提高有关。在剩余污泥体系中，原始剩余污泥微生物种群丰富度高[27]，群落结构复杂，水热预处理降低了细菌群落Chao1、Shannon 和Simpson 指数，这说明水热预处理降低了微生物群落丰富度和多样性，降低了竞争代谢微生物菌群。

表2 不同样品的Chaol、Shannon和Simpson指数

2.3.2 微生物群落结构分析

微生物门水平群落结构组成如图6所示，各发酵罐主要由厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）组成，其与厌氧发酵过程密切相关，能产生大量的酶，促进底物的水解酸化产乳酸和挥发性脂肪酸[28-29]。其中优势菌门Firmicutes在所有发酵罐中的相对丰度均超过40%，随着水热温度的升高，Firmicutes的相对丰度逐渐提高。在酒曲体系中，Firmicutes的相对丰度从44.81%（DY-B）提高到66.03%（DY-180），剩余污泥体系中Firmicutes的相对丰度从40.40%（WAS-B）提高到88.41%（WAS-180），研究表明Firmicutes对极端环境的耐受性较强，能适应不断酸化的环境，并且目前已经被证实有碳链延长功能的细菌大部分都属于Firmicutes[30]，因此水热预处理组戊酸产量的提高可能与这类微生物有关。

图6 不同水热预处理发酵体系下门水平群落结构组成

微生物属水平群落结构组成如图7所示，在酒曲体系中，DY-B组主要由双歧杆菌属（Bifidobacterium）（27.56%）和放线菌属（Actinomyces）（25.80%）组成，这两类微生物均与复杂有机物质的水解及乙酸和丁酸的生成有关[31]，因此DY-B 组丁酸产量高而戊酸产量低可能与这两类菌属有关。水热预处理后， 瘤 胃 球 菌 属（UBA1819）、 肠 球 菌 属（Enterococcus）、巨球菌属（Megasphaera）和小类杆菌属（Dialister）被选择性富集。其中，UBA1819和Enterococcus均与产乙酸和丙酸有关[32]，这可能是造成水热预处理组乙酸和丙酸积累的原因。研究发现Megasphaera和Dialister均是产戊酸功能菌群[33]，在DY-B 中，无Megasphaera和Dialister富集，而DY-100、DY-140、DY-160 和DY-180 中Megasphaera的相对丰度分别提高到2.13%、16.02%、4.52%和13.77%；Dialister的相对丰度为0%、2.86%、6.65%和2.26%。结果表明，水热预处理实现了产戊酸相关功能菌群的富集，这可能是水热预处理组戊酸产量高的原因。

图7 不同水热预处理发酵体系下属水平群落结构组成

在剩余污泥体系中，发酵罐中均含有可以将底物水解、 酸化以及产乳酸的链球菌属（Streptococcus）[34]。在WAS-B、WAS-100、WAS-140、WAS-160 和WAS-180 中的相对丰度分别是14.09%、13.60%、53.52%、69.92%和72.92%，随着水热温度的提高，Streptococcus的相对丰度逐渐提高。除此之外，所有的反应器中均选择性富集了巨球菌属（Megasphaera） 和普雷沃氏菌属_7（Prevotella_7），Megasphaera在WAS-B、 WAS-100、WAS-140、WAS-160 和WAS-180 中的相对丰度分别是6.21%、12.38%、9.22%、9.77% 和9.35%，水热预处理提高了Megasphaera的相对丰度；Prevotella_7 在WAS-B、 WAS-100、 WAS-140、WAS-160 和WAS-180 中的相对丰度分别是1.68%、1.04%、2.99%、1.04%和1.19%。已有研究证明Megasphaera和Prevotella_7 可以产生高浓度丙酸和戊酸[35]，水热预处理组产戊酸功能菌群的总相对丰度高于空白组，这可能是水热预处理组戊酸产量升高的原因之一。另外，WAS-B 中产戊酸功能菌群的相对丰度是7.89%，而DY-B 无产戊酸功能菌群的富集，因此WAS-B 中戊酸的产量高于DY-B。

3 结论

（1）水热预处理可以显著提高戊酸的产量，在水热预处理温度为180℃时，戊酸的产量达到最大值。在接种酒曲体系中，戊酸的产量从3.47g COD/L 提高至16.19g COD/L，与空白组相比提高了3.66倍；在接种剩余污泥体系中，戊酸的产量从10.64g COD/L 提高至18.55g COD/L，与空白组相比提高了0.74倍。

（2）水热预处理提高了发酵体系中丙酸的产量，降低了庚酸和己酸的产量，调控了发酵体系的醇酸比，促进乙醇和丙酸转化为戊酸。

（3）水热预处理促进了产戊酸功能菌群的高效富集。在接种酒曲体系中，空白组无与产戊酸相关功菌群的富集，水热预处理温度为180℃时与产戊酸相关功菌群Megasphaera和Dialister的相对丰度分别增加至13.77%和2.26%；在接种剩余污泥体系中，空白组Megasphaera的相对丰度为6.21%，水热预处理温度为180℃时Megasphaera的相对丰度最高加至9.35%。