细胞内钾离子稳态测量技术及其调控机制研究进展

颜芷昕 宋娜娜，3 丁小强△

（1复旦大学附属中山医院肾内科 上海 200032； 2上海市肾病与血液透析重点实验室 上海 200032；3复旦大学张江研究院 上海 200120）

维持机体钾平衡是保证多种生命活动正常运行的必要条件，钾平衡紊乱会导致多系统、多器官的异常，机体钾缺乏可促心血管疾病［1］、慢性肾脏病［2］的发生和发展。临床上一般用血钾和尿钾水平来评估机体钾的平衡状态，这些指标主要反映细胞外液钾离子水平。然而，越来越多的研究提示细胞外液钾离子浓度不够灵敏和真实地反应机体钾水平，如长期低钾饮食可使血钾浓度依旧接近正常值，但此时机体的低钾状态已造成肾损伤指标的升高［3］，因此需要一个更真实更灵敏的指标反映机体钾水平——细胞内钾离子浓度可能更为合适。钾离子在细胞内外并非呈均衡分布，细胞内液钾离子浓度（150 mmol/L）约是细胞外液（3.5～5 mmol/L）的30倍［4］。在慢性肾脏病的模型中，尽管此时的血钾浓度可能并无明显改变，但细胞内钾离子浓度明显减少，及时纠正细胞内低钾的情况可改善细胞周期阻滞及肾脏纤维化［5］，细胞内液钾离子可能作为细胞外液的缓冲系统，较细胞外液先发生平衡紊乱，因此细胞内液钾离子水平更灵敏地反映机体钾状态。此外，维持细胞内钾离子稳态可调节能量代谢、细胞增殖和死亡等过程［6-7］，维持细胞内钾离子稳态具有重要的意义。

细胞内钾离子稳态基本情况细胞内钾离子稳态有两个层面：一是细胞内液总钾平衡，二是亚细胞结构钾离子的分布平衡。囿于技术限制，关于细胞器中钾离子的分布以及细胞内钾离子浓度在不同生理和病理条件下的动态变化一直未有定论，但随着近几年关于靶向亚细胞结构的荧光探针、基因编码钾离子指示剂及光学技术的发展，研究者在几个不同类别的细胞中均发现：胞核的钾离子浓度最高（150～350 mmol/L）且细胞核基质的浓度高于核周间隙，细胞基质的钾离子浓度居中（50～100 mmol/L），线粒体（40～50 mmol/L）、内质网（2～8 mmol/L）和溶酶体（2～50 mmol/L）的钾离子浓度较低［8-10］，需要注意的是不同类型的细胞、不同病理状态下细胞内钾离子情况并不相同。

细胞内钾离子浓度的测定长久以来，对细胞内钾离子浓度的测定是研究细胞内钾离子相关生理病理研究的瓶颈，直接测量难度较大、操作繁琐，更多的研究是采用间接测量（电生理）的方法，通过对离子通道电流的分析间接推断细胞内钾离子的情况（表1）。

表1 细胞内钾离子浓度测量方法Tab 1 Measuring methods of intracellular K+ concentration

原子吸收光谱法 将细胞裂解后对裂解液进行光谱分析，准确度高且可定量，但具有细胞破坏性。

核磁共振波谱法（39K-nuclear magnetic resonance，39K-NMR） 据核磁共振的原理测量钾，操作时收集待测细胞至特殊小管，根据得到的谱图进行分析［11］，此方法无细胞损伤性，但灵敏度和精确度低且难以获得亚细胞结构的分布信息。

钾离子选择性玻璃电极法 玻璃电极由钾离子选择电极和参比电极共同组成，其中钾离子选择电极含特殊的含缬氨霉素的聚氯乙烯膜成分，当电极破坏细胞膜和细胞内液接触后，可在聚氯乙烯膜上产生电位并与参比电极构成回路获得电极电位，以此计算出细胞内钾离子浓度。此方法准确、敏感度高［12］，但具有细胞损伤性且无法获取钾离子在细胞内的时空分布情况。

合成钾离子敏感的荧光染料法 荧光探针可选择性螯合细胞内游离钾离子，当钾离子与探针结合后可改变探针的构象，增加其量子产率，使光谱发生偏移，通过分析产生的荧光信号可获得细胞内钾离子浓度的数据。理想的钾离子荧光探针应满足对生理条件下细胞内钾离子浓度变化的敏感性以及选择特异性。PBFI是应用最早和最广为人知的钾离子荧光探针之一，但是它对钾离子的选择性差，易受到钠离子干扰，而且操作繁琐。后来研究者研制出钾离子选择性更高的探针，如KS2探针［13］和可降低假阳性率并用于活细胞成像的双荧光探针［14-15］；还有能定位于亚细胞结构的钾离子探针，如半定量检测线粒体内钾离子浓度变化的KS6探针［16］。

基因编码的钾离子指示剂 研究者发现生物体内存在可螯合钾离子的钾离子选择性蛋白，为了改善化学合成荧光探针有一定细胞毒性、特异性差、低通量的缺点，他们提出可采用基因工程的方法，通过在原核生物体内共表达和提纯具有高度钾离子选择性蛋白和荧光蛋白进而获得基因编码的钾离子指示剂，并认为此方法更安全、高效［8］。此外，在钾离子指示剂上添加细胞器特异序列可实现靶向亚细胞的钾离子动态监测，推进对细胞器钾离子功能的研究，目前有靶向线粒体的KS6［16］、Mt lc-LysM GEPII钾离子探针［8］以及靶向细胞核的NUClc-LysMGEPII钾离子探针［8］，这些探针具有高灵敏性、特异性、时空分布性、高通量的优势。目前基于双荧光能量共振转移发光方式的指示剂有：GEPII系列［8］、KIRIN1-GR［17］；基于单荧光的有GINKO，和双荧光发光方式相比，单荧光团体积小、适用于多荧光检测［17］（表1）。

细胞内钾离子稳态的调控机制由于钾离子不能自由进出细胞膜结构，细胞内液钾离子浓度稳态依赖于细胞膜上特殊通道的开放程度和细胞内外钾离子电化学梯度；而亚细胞结构的钾离子分布平衡则依赖于细胞器膜上的特殊通道（图1）。

图1 细胞内钾离子稳态的基本情况及调控机制Fig 1 Intracellular K+ distribution and machinery for K+ regulation

细胞内总钾平衡 钾离子在细胞内外形成的电化学梯度和膜上的孔道性质共同决定钾离子的进出方向，细胞膜上钾离子流动的孔道主要有：钾特异性通道、钾离子交换体、钠钾泵、非选择性阳离子通道和特殊“膜孔”结构。（1）钾通道是钾离子流动最常见的孔道，根据门控机制、结构和功能主要分成了5个家族：电压门控钾通道KV；内向整流钾通道Kir；钙和钠激活大电导钾通道SLO；小电导钙激活钾通道 SKCa以及双孔钾通道K2P［22］。由于胞内钾离子浓度明显高于胞外，大多钾通道在一般生理条件下顺电化学梯度介导钾离子由胞内流向胞外。（2）钾离子交换体和转运体：如氢-钾交换体（钾离子进出方向取决于两种离子在细胞内外的浓度差，酸中毒时氢离子转运入胞内，钾离子转运出胞外）和钠钾二氯同向转运体（介导钾离子内流入胞）等；（3）钠钾泵：将钾离子逆浓度梯度转运至胞内，维持胞内高钾环境；（4）非选择性阳离子通道：如瞬时受体电位阳离子通道亚家族（transient receptor potential channel，TRPC），介导钾离子由胞内流向胞外；（5）特殊膜孔：焦亡效应蛋白gasdermin D在胞膜上形成孔结构，结合钾离子并介导钾离子外流［23］。当钾离子由胞内流向胞外时，细胞内钾离子浓度减小；反之，细胞内钾离子浓度增多。改变细胞外液钾离子浓度，如增加细胞外钾离子浓度可减弱电化学梯度，减小钾离子外流，使胞内钾浓度增多。

亚细胞结构间钾离子分布的平衡 钾离子在细胞内并非均匀分布，在钾通道的调节下维持亚细胞结构间钾离子分布平衡（表2），胞核钾离子浓度最高，细胞基质次之，其他细胞器（线粒体、溶酶体、内质网等）浓度最低。目前亚细胞结构的膜上的钾离子通道研究仍非常有限，一般认为钾离子的流动方向是由胞浆流入线粒体、内质网、溶酶体和细胞核基质。细胞核维持高钾离子水平的机制，细胞器膜上是否存在其他钾离子孔道（如交换体等）待进一步研究。

钾离子通道的调控机制由于钾通道对钾离子的高度特异性，钾通道在细胞内钾离子稳态调控占主体地位。目前已发现的钾通道有80多种，每种钾通道的调控机制各不相同。总体而言，主要包括通道本身的门控机制（电压、机械张力、ATP、pH等）和信号分子对通道活性和表达水平的调控（如炎症、氧化应激相关信号分子）。

门控机制 作为钾离子通道本身的特性，钾离子通道的开放可由膜电位/电压（如电压门控钾通道Kv家族）、胞内外pH（如酸敏感的双孔钾通道TASK2）、机械刺激（如弱内向整流相关双孔钾通道TREK1）、ATP水平（如ATP敏感的钾通道KATP）、胞内其他阳离子（Ca2+、Mg2+、Na+）浓度、G蛋白偶联受体激活的G蛋白信号通路（如被激素激活）等调控。

信号通路 （1）炎症相关信号通路：炎症过程中产生的细胞因子可调控钾通道活性，γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）通过与细胞膜上的受体结合，在近端肾小管细胞内产生过氧化物或过氧化亚硝基，使钾离子通道发生氧化或亚硝基化进而被抑制；白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）可激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路，抑制钾离子通道［24］。（2）氧代谢相关信号通路：多种钾通道和氧化应激或氧代谢通路相关。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是氧感受通路的关键转录因子，研究发现缺氧通过增加HIF-1上调钾通道表达水平，如在肺动脉平滑肌细胞中上调BKCa表达［25］以及在B淋巴细胞中上调TASK2表达［26］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是缺氧过程中线粒体代谢产物，线粒体ATP敏感的钾通道常在缺氧的条件下被ROS产物活化［27］。ROS还可氧化修饰钾通道进而改变通道活性，BK通道位于细胞内的3个蛋氨酸被ROS氧化修饰后活性增强而半胱氨酸被氧化修饰后活性减弱［28］。细胞内钙离子浓度增加也常见于氧化应激过程，可激活钙敏感钾通道的开放。氧化应激过程还可通过激活cAMP/GMP依赖的蛋白激酶信号通路磷酸化钾通道亚基，进而改变通道的活性。

细胞内钾离子稳态的生理作用细胞内钾离子基本功能是维持细胞静息膜电位，这是可兴奋细胞正常发挥其兴奋功能的必要条件。此外，钾离子还参与调控多种生命活动（图2）。

调节酶及能量代谢 细胞内钾离子通过稳定酶结构维持酶活性［29］，如丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶、DNA双链断裂修复蛋白RAD51等；也可作为酶的辅因子，如钾离子是己糖激酶Ⅱ的辅因子，促葡萄糖分解［6］。此外，细胞内钾稳态参与细胞能量代谢过程：胞内钾离子浓度降低时，AMP依赖的蛋白激酶通路活化，糖酵解过程被抑制，线粒体ATP生成减少，线粒体氧化磷酸化功能受抑制［6］。激活线粒体钾通道，促线粒体内膜去极化，促呼吸链运行和ATP生成，脂肪酸氧化过程加强［30］。

调节遗传物质的生物合成 细胞内钾离子可与DNA结合，稳定核酸G-四链体结构，调节DNA复制［31］；胞内钾离子参与调节转录因子的转录活性：抑制核膜上的钾离子通道开放（如BKCa、KV1.3等），促核膜超极化，最终导致环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）磷酸化，促进c-fos等极早期反应蛋白转录［10，32］。

调节细胞容积和形态 细胞内钾离子维持细胞容积的稳态：钾离子是胞内浓度最高的阳离子，是维持细胞内渗透压的主要组成成分；而细胞内外的渗透压差决定细胞液体流动方向，影响细胞的容积和形态。凋亡相关细胞容积减小与钾离子通道激活介导的钾离子外流相关［33］；当细胞过度肿胀时钾离子通道也会被激活，进而降低细胞内钾离子浓度，减小细胞内的渗透压，抑制肿胀进一步加剧［34］。

调节细胞周期和增殖 增殖是细胞的基本功能，其中细胞周期的精准调控保障增殖的有序进行。最初研究者发现非兴奋性细胞的细胞周期中伴随着膜电位的周期性变化，G1期→S期超极化，G2期→M期去极化［35-36］；而钾离子是维持静息膜电位的主要离子，研究进一步发现细胞内钾离子浓度的改变可直接影响细胞周期和增殖，抑制外周血淋巴细胞钾离子通道活性或增加细胞外液钾离子浓度进而提高细胞内钾离子浓度，可抑制淋巴细胞增殖和分泌细胞因子［36］；我们团队发现体外诱导纤维化的近端肾小管上皮细胞以及体内纤维化肾脏模型中细胞内钾离子浓度减低，并促进上皮细胞G2/M期阻滞［5］。同时，钾电流和钾离子通道的表达水平可随细胞周期变化［37］，钾通道是调控细胞内钾离子稳态的重要手段，钾离子通道的开放通过影响细胞内钾稳态进而调节细胞周期。

然而细胞内钾离子调控细胞周期的具体机制尚缺乏统一的认识，目前有如下几种学说：（1）钙学说：细胞内钾离子浓度的减低为钙离子内流提供驱动力，促使细胞内钙离子浓度的升高，钙离子作为第二信使启动Ca2+—钙调蛋白/钙调素依赖蛋白激酶（calmodulin/calmodulin kinase，CaM/CaMK）通路调控细胞周期关键蛋白，比如上调细胞周期抑制因子p27、p21等表达，阻滞细胞周期［37］；（2）信号通路学说：钾离子通过调控cAMP依赖蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen activated protein kinases，P38-MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）以及蛋白激酶B（Akt）相关信号通路改变细胞周期蛋白的表达水平［38］，但需更多的研究证实。

调节细胞死亡 胞内钾稳态调控与凋亡的发生密切相关，凋亡的其中一个特征是细胞容积减小，而钾离子作为胞内含量最高的离子对细胞容积的调控至关重要，胞膜钾通道的激活、钾离子外流和细胞内钾离子浓度降低均可促进凋亡发生［33］。线粒体内膜上的钾通道和线粒体钾离子稳态也参与调控死亡，抑制线粒体钾离子通道（TASK3、KV等）可促进ROS释放、抑制呼吸链并诱导死亡［30］；还有研究提示激活线粒体钾离子通道SK、增加线粒体钾浓度可减轻细胞铁死亡［39］。

调节细胞迁移和修复 细胞（尤其是表皮细胞）迁移是发生损伤修复的重要手段之一，迁移过程包括细胞骨架重构、细胞膜突出、前部的细胞外基质的局部黏附和后部的细胞外基质去黏附。研究者发现细胞迁移过程中细胞膜上的钾离子通道分布不均匀，如肾上皮细胞发生迁移时，KV1.4通道聚集在板状伪足的前部突出部分，抑制这部分的钾离子通道会抑制细胞迁移，而KCa通道分布在胞体尾部，抑制这部分的离子通道同样会抑制细胞迁移［40］；迁移相关信号通路如受体蛋白酪氨酸激酶（如表皮生长因子及受体）及非受体蛋白激酶（如ERK）信号通路的激活可上调钾离子通道的表达、增加钾离子外流进而促进细胞迁移。同时迁移信号通路也受钾离子通道调控，抑制钾离子通道可抑制迁移信号通路［41］。

目前钾离子调控细胞迁移修复的机制包括：（1）钾通道开放、钾离子的外流为钙离子内流提供驱动力，通过激活钙信号通路促进细胞迁移［42］；（2）细胞内钾离子直接可作为第二信使调控迁移相关蛋白合成［43］，也可调节局部渗透压与容积，调控肌动蛋白促进细胞骨架重构［44］；（3）通过改变局部离子浓度影响细胞外基质组装、交联过程［42，45］。

调节免疫应答 细胞内钾离子通过炎症小体（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）活化、炎症因子生成和免疫细胞功能调节参与机体的免疫应答。NLRP3介导的炎症反应常伴随着细胞内钾离子外流、细胞内钾离子浓度减低的现象［46］，细胞内钾离子外流促进NLRP3进一步形成，激活细胞死亡的过程［23，47］。细胞内钾离子外流可抑制DNA感受器环GMP-AMP合酶-干扰素刺激基因（cyclic GMP-AMP and the stimulator of interferon genes，cGAS-STING）反馈通路，调控I型干扰素的生成［23］。免疫细胞（T/B/NK细胞）上的钾离子通道开放及其介导的细胞内钾离子外流还可通过膜超极化为钙离子的内流提供驱动力、增加细胞内钙离子浓度，钙离子作为第二信使可活化转录因子进而诱导下游基因转录促免疫细胞成熟、分化及发挥效应［48-49］，如钾通道KV1.3和IKCa2的激活可促活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）的核定位并启动下游基因转录，促T细胞增殖和分泌细胞因子［50］。

细胞内钾离子稳态失衡和疾病的联系

肿瘤 在多种肿瘤（如乳腺癌、宫颈癌、神经胚胎瘤、结肠癌、急性髓性白血病等）存在钾通道表达异常［51-53］，研究进一步发现肿瘤的组织间液的钾离子浓度升高［7］，二者均可影响细胞内钾离子稳态，细胞内钾失衡和肿瘤密切相关。细胞内钾稳态失衡促肿瘤发生发展的机制复杂多样，涉及细胞增殖死亡、损伤修复和免疫功能异常。细胞内钾稳态失衡破坏细胞周期的有序进行，细胞周期蛋白（如cdc25、cdc2）表达异常［54］，促肿瘤细胞不断分裂增殖；钾离子通道（如KCa家族、KV通道家族）活化可促肿瘤细胞DNA损伤修复，增强肿瘤细胞对放化疗的抵抗性［55］，高表达钾离子通道的肿瘤组织可能提示不良预后；细胞内钾离子还参与调节肿瘤免疫，肿瘤微环境的钾离子浓度高于正常组织的细胞外液，造成其中的T细胞内钾离子浓度升高，增强磷酸酶PP2A的活性并抑制蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白（Akt-mTOR）通路磷酸化程度，最终抑制T细胞发挥效应，削弱对肿瘤细胞的杀伤作用［7］。

急性缺血相关疾病 细胞膜钾通道（KV、KATP、TREK1等）开放可通过抑制钙超载、促DNA损伤修复和减轻凋亡在多种急性缺血性脏器损伤中发挥保护作用，包括急性心肌梗死［56］、卒中［57］、急性缺血再灌注肾小管损伤［58］等。线粒体内膜钾通道（如BK）的开放可减轻缺血诱导的心肌损伤——阻断或抑制线粒体BK通道可抑制线粒体呼吸链，增加ROS产生，增加细胞凋亡，最终加剧心肌损伤［59-60］。

自身免疫疾病 钾通道的异常表达（增多或减低）、异常功能及其介导的细胞内钾离子稳态失衡和自身免疫疾病的发生发展密切相关，包括系统性红斑狼疮［61］、多发性硬化［62］、炎症性肠病［62-63］、类风湿性关节炎［64］等，其中的病理生理机制尚未明确。自身免疫疾病模型中的免疫细胞（B/T/NK细胞）常见钾离子通道表达上调、功能过度活化以及细胞内钾离子浓度减低，细胞内钾离子浓度异常减低可促进免疫细胞的异常活化，而免疫细胞的过度激活是自身免疫疾病的重要发病机制之一［65］；而在病变脏器常见钾离子通道表达减少、通道活性受抑制，最终抑制组织器官发挥功能［66］。

内分泌疾病 内分泌器官的钾离子通道和细胞内钾离子稳态维持内分泌激素的正常分泌，钾离子通道表达减少、功能缺失可见于糖尿病（新生儿糖尿病［67］、2型糖尿病［68］）以及高醛固酮血症［69］，并造成激素分泌紊乱。肾上腺钾通道（如TASK1、TASK3）的缺失造成细胞内钾离子浓度升高、细胞持续去极化，细胞兴奋周期被破坏、钙离子内流增强，不断合成和分泌醛固酮激素［70］。

神经退行性疾病 近年研究者发现钾通道表达减少和功能受损常见于神经退行性疾病，包括亨廷顿病［71］、帕金森病［72］、阿尔兹海默病［73］等，并可作为疾病治疗的重要靶点之一。胞膜上的钾通道表达减少、细胞内钾离子浓度升高可直接导致神经系统的兴奋毒性、细胞受损和神经环路的破坏［74］；激活线粒体钾通道如KATP可减轻线粒体损伤、保护胆碱能中间神经元，最终缓解亨廷顿病［75］；TMEM175是钾离子进出溶酶体的主要通道并维持溶酶体功能［76］，TMEM175表达减少与功能缺失可通过抑制溶酶体功能，加剧α-突触核蛋白的异常沉积、多巴胺神经元的减少和运动功能损害，最终促进帕金森病的进展［77］。

结语钾离子主要分布于细胞内液，细胞内钾离子稳态的改变往往先于细胞外液。细胞内钾稳态由细胞内、外液和细胞器间钾离子分布平衡共同维持，参与细胞生长死亡、黏附迁移、能量代谢和免疫调控等多种活动。细胞内钾离子稳态失衡与肿瘤、急性缺血、自身免疫、内分泌、神经退行性等疾病的发生发展密切相关，并提示疾病进展、预后，靶向干预钾离子通道以及纠正细胞内电解质水平为临床提供了新的治疗思路。受测量细胞内钾离子浓度检测技术的限制，先前大多数研究都是通过钾通道的功能变化间接推测细胞内钾离子浓度的改变，缺乏细胞内钾稳态失衡与疾病发生发展相关性的直接证据，总体上对胞内钾离子的调控机制及在细胞功能调控中的作用机制的认知是远远不够的。近年钾离子敏感的荧光探针和基因编码的钾离子指示剂技术手段的发展将进一步促进人们对细胞内钾离子稳态调控机制的探索，并为疾病的诊疗提供新的方向。

作者贡献声明颜芷昕 文献检索，综述撰写，绘图，制表。宋娜娜 综述修订和审校。丁小强 综述构思和审校。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。