健脾化湿方对右旋葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响

徐张扬,蒋蓓尔,张建,刘光盛,3,王杨凯,闵天骄,何颖

(1.海军特色医学中心海洋生物医药与极地医学研究室,上海 200433;2.海军军医大学基础医学院,上海 200433;3.海军军医大学研究生院,上海 200433)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性非特异性的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),其临床症状主要以腹痛、腹泻和血便为主,常伴有发热、肿胀、恶心、呕吐等症状[1]。随着生活压力的增大以及饮食结构的改变,该病在我国的发生率不断增高。UC的发病机制尚不明确,涉及环境因素、遗传、免疫平衡失调及肠屏障缺陷等多个方面[2-3]。近年来,多项研究表明,肠道微生物与机体免疫系统的平衡失调在UC的发生发展中具有重要作用[4-7]。肠道微生物的组成差异不仅影响了肠上皮屏障的完整性,且对肠道内各种代谢物的产生起重要作用[8]。因此,调控UC患者紊乱的肠道微环境将成为治疗UC的新型治疗手段[9]。

目前,UC的临床治疗以西医为主,主要包括糖皮质激素、氨基水杨酸类药物和免疫抑制剂等,但这类药物长期使用具有明显的毒副作用,且疗效不尽人意[10-12]。近年来,中医药治疗UC效果显著,不良反应较少且复发率低[13-15]。本研究基于中医基础理论,认为UC的病机多为本虚标实,以脾虚、肾虚为本,湿热为标[14,16]。因此参考王长洪教授提出的治疗UC的学术思想[17],即温中健脾、清热祛湿和活血化瘀,自拟了由山药、焦山楂、陈皮、炒薏苡仁四味药食同源的中药组成的,具有健脾止泻、缓解胃肠功能紊乱的健脾化湿方,探究其对UC的治疗效果,并通过16S rRNA测序技术研究其对UC小鼠肠道菌群的影响,为健脾化湿方治疗UC的合理使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验动物SPF级C57BL/6雄性小鼠32只,6～8周龄,体重18～20 g[上海灵畅生物科技有限公司,许可证号为SCXK(沪)2013-0018]。饲养于海军特色医学中心实验动物中心,许可证号为SYXK(沪)2017-0019。温度18～22 ℃,相对湿度50%～60%。试验前小鼠正常饮食、饮水,适应性喂养3 d。本研究中所有动物实验均经过海军特色医学中心动物伦理实验委员会批准实施。

1.2 药品与试剂葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)(美国MP Biomedicals公司,批号:02180139);TNF-α ELISA试剂盒(批号:YX-201407M)、 IL-6 ELISA试剂盒(批号:YX-091206M)、IL-1β ELISA试剂盒(批号:YX-091203M)均上海百舰生物科技有限公司;美沙拉嗪缓释颗粒(上海爱的发制药);健脾化湿方:山药15 g、焦山楂7 g、陈皮3 g和炒薏苡仁15 g组成,由北京康仁堂药业制备成健脾化湿方免煎颗粒,相当于含生药6.065 g·kg-1。

1.3 主要仪器与设备高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司);生物显微镜(德国Leica公司);Multiskan FC全自动酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);ABI ViiATM实时荧光定量PCR(美国Applied Biosystems公司);NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药将32只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组8只,分别为正常对照组、模型组、美沙拉嗪组(600 mg·kg-1)和健脾化湿组(800 mg·kg-1)。各组小鼠适应性喂养3 d后,正常对照组给予正常饮用水,其余3组替换成含3%DSS的饮用水,自由饮用7 d,诱导小鼠UC模型,第8～9天均给予正常饮用水。自造模第1天起同步进行灌胃给药,正常对照组和模型组每天给予0.2 mL生理盐水,其他各组每天给予0.2 mL相应药物溶液,每天给药1次,连续给药9 d。每日观察并记录实验小鼠的一般情况、体质量、摄食量和饮水量,以及大便性状和便血情况(见表1)。

表1 粪便状态和便血情况评分

1.4.2 样本采集与处理于实验第9天,采用颈椎脱臼法处死所有小鼠,分离整段结肠,测量各组小鼠结肠长度并进行统计学分析。纵行剖开整段结肠,取结肠内粪便颗粒(2～3粒)于冻存管中,迅速放入液氮内,并于-80 ℃冰箱保存。用预冷PBS多次冲洗结肠组织。取各组小鼠相同位置的结肠组织(1 cm)放入10倍体积的4%多聚甲醛溶液中,室温静置24 h进行固定。另取1 cm结肠组织于EP管,加入5倍体积生理盐水匀浆,静置离心后取上清液于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 结肠组织病理形态学分析取4%多聚甲醛溶液固定后的结肠组织进行常规的石蜡包埋、切片、HE染色,在光学显微镜下观察各组小鼠结肠组织的形态学变化(见表2)。

表2 病理学组织评分

1.4.4 结肠组织中炎症因子检测取低温保存的结肠组织匀浆上清液,快速复苏,并按ELISA试剂盒方法检测各组小鼠炎症因子TNF-α、IL-1β 和IL-6水平。

1.4.5 粪便中细菌DNA的提取及检测用E.Z.N.A.Stool DNA Kit试剂盒提取粪便中的总DNA,用紫外分光光度计检测DNA的浓度,并通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量。

1.4.6 PCR扩增和产物回收以细菌16S rRNA的V3～V4可变区序列为靶标,使用带Barcode序列的特异引物(338F-806R)进行PCR扩增,获得PCR产物并用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物。

1.4.7 文库构建和高通量测序通过Agilent 2100生物分析仪(Agilent,美国)和Illumina(Kapa Biosciences,Woburn,MA,美国)的文库定量试剂盒分别评估扩增子文库的大小和数量。在NovaSeq PE250平台上对库进行排序。

1.5 统计学分析使用SPSS 27和Graphpad Prism 9软件进行统计分析并制图。其中体重下降率采用两因素重复测量资料的方差分析;粪便黏稠度和便血程度采用非参数检验克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test);多组间均数比较采用单因素方差分析,并使用图基检验(tukey test)进行事后检验。肠道菌群样本结构差异分析采用主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)、相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM)和置换多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)进行组间差异检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般体征情况如图1所示,正常对照组小鼠状态良好,摄食和饮水正常,体重没有明显变化;模型组自造模开始后,摄食饮水逐日减少,活动能力下降,毛色黯淡无光泽,从造模第6天起,体重下降较正常对照组有统计学意义(P<0.05),美沙拉嗪组和健脾化湿组小鼠体重也有一定的降低,但下降幅度小于模型组,于第7天起同模型组比较呈显著性差异(P<0.05)。造模第3天开始,模型组小鼠排便次数增加,出现软便、稀水样便等情况,第5天出现粪便隐血、脓血便等情况,两个给药小鼠组同样也出现水便、血便等症状,但症状均轻于模型组。因此,健脾化湿方能有效改善实验小鼠结肠炎症状。

A.体重变化量;B.平均粪便黏稠度评分;C.平均便血程度评分

2.2 小鼠结肠长度变化如图2所示,与正常对照组相比,模型组小鼠结肠长度显著缩短(P<0.001),肠管充血出现不同程度的水肿,肠腔内存留大量稀便;与模型组相比,美沙拉嗪组和健脾化湿组小鼠结肠长度增加,且健脾化湿组与模型组相比具有统计学差异(P<0.001)。

图2 健脾化湿方对DSS诱导的UC结肠长度的影响

2.3 HE染色及病理组织学评分如图3A所示,正常对照组小鼠结肠组织结构完整,肠腺上皮细胞形态正常,排列紧密,黏膜未见炎性细胞浸润;模型组小鼠结肠组织结构完全被破坏,黏膜层肠腺排列不规则甚至消失,并伴有大量炎性细胞浸润;健脾化湿组小鼠给药后结肠组织完整性明显改善,腺体结构相对完整,炎性细胞浸润减少,其药效优于阳性药美沙拉嗪。病理组织学评分结果如图3B所示,模型组小鼠结肠病理评分显著高于正常对照组(P<0.001);与模型组相比,健脾化湿组评分显著降低(P<0.001),结果表明健脾化湿方能有效改善DSS诱导的结肠损伤。

A.结肠组织HE切片染色情况(×40);B.HE切片病理组织评分情况

2.4 结肠组织中炎症因子检测结果如图4所示,与正常对照组相比,模型组小鼠结肠组织中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著升高(P<0.001)。与模型组相比,美沙拉嗪组及健脾化湿组的3个炎症因子表达均显著降低(P<0.001)。因此,健脾化湿方与美沙拉嗪都能有效抑制UC小鼠局部结肠组织促炎因子的表达。

A.TNF-α含量;B.IL-1β含量;C.IL-6含量

2.5 肠道菌群测序结果

2.5.1 UC小鼠结肠组织菌群多样性分析α多样性反应微生物菌群的丰富度和均匀度,常用于比较不同分组中物种多样性的差异。我们采用2个指标分别进行评价:Chao1和Shannon,其中Chao1反映样本中菌群丰富度,但不考虑细菌群落每个物种的丰度情况,而Shannon指数则反映物种的丰富度和均匀度,Shannon值越高,说明物种多样性越高。结果如图5所示,DSS诱导的UC小鼠肠道菌群多样性显著降低(P<0.001),经美沙拉嗪和健脾化湿方治疗后,2组小鼠肠道菌群多样性有了一定提高,但给药组和模型组间差异无统计学意义。为了进一步比较不同分组间微生物群落整体组成的相似性和差异情况,我们进行了加权的主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA),基于weighted_unifrac距离计算物种的距离并排序,根据排序计算前两轴的坐标位置而得到图6。同时进行相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM),比较组间和组内差异的大小。R值为0.693 7,趋向于1,提示组间差异大于组内差异,且P=0.001<0.05,表示不同的干预措施下的组间物种组成差异具有统计学意义。

A.肠道菌群多样性Chao1指数;B.肠道菌群多样性Shannon指数

图6 健脾化湿方对DSS诱导的UC小鼠肠道菌群β多样性的影响(n=5)

为进一步明确不同处理方式两两之间对物种组成差异的影响,我们进行了pairwise.adonis配对检验,如表3所示,健脾化湿组与模型组、健脾化湿组与正常对照组和美沙拉嗪组与正常对照组的组间微生物物种组成具有显著差异(P=0.01),而健脾化湿组与美沙拉嗪组的微生物物种组成无统计学差异(P=0.094),提示与模型组相比,健脾化湿方与美沙拉嗪的干预处理对微生物群落组成的影响具有相似或统计学一致性,但仍与正常对照组存在显著差异。因此,健脾化湿方能有效调节并在一定程度上恢复UC小鼠肠道菌群的多样性。

表3 配对ADONIS分析结果(n=5)

2.5.2 UC小鼠结肠组织菌群结构和差异分析采用QIIME 2分析流程,将feature(特征)数据与16s数据库进行序列比对,鉴定各组在门和属水平的物种组成差异。结果显示,在正常对照组中,拟杆菌门(79.26%)、厚壁菌门(16.40%)、变形菌门(1.01%)、Epsilonbacteraeota(0.63%)为4大主要细菌门类。S24-7菌、Alloprevotella、Muribaculum、Alistipes是正常对照组属水平上的主要构成。在模型组中,厚壁菌门(60.23%)、Epsilonbacteraeota(15.55%)、拟杆菌门(13.91%)、变形菌门(8.44%)为4大主要的细菌门类。相较正常对照组而言,模型组厚壁菌门、Epsilonbacteraeota和变形菌门比例有所上升,而拟杆菌门比例显著下降。在健脾化湿组中,拟杆菌门(41.38%)、厚壁菌门(32.02%)、疣微菌门(11.67%)和变形菌门(6.66%)为4大主要的细菌门类,其中拟杆菌门和厚壁菌门的占比与正常对照组相似,而疣微菌门首次出现在主要菌种中,提示该菌在缓解UC过程中可能发挥重要作用。进一步通过LEfSe(LDA值>4)进行菌群差异分析。结果显示,拟杆菌门、f_Muribaculaceae、g_Alloprevotella是正常对照组主要的显著差异菌;模型组中显著性最高的为f_Helicobacteraceae、p_Epsilonbacteraeota、c_Campylobacteria、f_Ruminococcaceae;健脾化湿组的差异菌群主要是p_Proteobacteria、c_Gammaproteobacteria、f_Enterobacteriaceae、g_Akkermansia。以上结果表明,健脾化湿方给药干预后,拟杆菌门比例显著增高、厚壁菌门和变形菌门比例显著降低,此外Akkermansia、Alloprevotella等益生菌比有所上升,提示菌群结构和组分的改变可能在溃疡性结肠炎发病中发挥重要作用。

3 讨论

UC的临床症状主要以腹痛、腹泻和血便为主,病程长,病情迁延反复,在中医里属“肠澼”“痢疾”“泄泻”等范畴[18]。其病机多以脾虚为本,湿热为标,血瘀贯穿疾病始末。在脾虚的基础上因外感湿邪或情志不遂,热毒内蕴,久蕴成毒。脾胃受损,湿热内蕴,清浊不分,混杂而下,并走肠间,以致UC[19]。本研究基于此,创立了具有健脾止泻、缓解胃肠道功能紊乱的健脾化湿方。该方由四味药食同源的中药组成,其中山药可补脾养胃,用于脾胃虚弱,食少体倦或便溏、泄泻[20-21];焦山楂活血化瘀、消食导滞[22];陈皮理气调中,燥湿化痰[23-24];炒薏苡仁利水胜湿而健脾。本研究结果证明,健脾化湿方能显著改善小鼠体重,减轻腹泻和便血症状,组织病理学结果显示,肠道炎细胞浸润减少,肠黏膜状态恢复良好。

尽管UC的发病机制目前尚不清楚,但肠道菌群与UC的关系是近年来的研究热点[25-28]。一系列临床研究发现,UC患者和健康对照者肠道细菌存在显著差异。Mafarlane等[29]通过16S rRNA荧光探针原位杂交法探究UC患者直肠活检样本中的菌群组成,发现双歧杆菌比正常组减少约30倍;多中心临床研究结果显示,UC患者大肠杆菌数量显著高于正常正常对照组,但双歧杆菌和乳酸杆菌数量低于正常组[30]。肠道菌群在UC中发挥重要作用,多表现为正常菌群破坏、细菌多样性降低和致病菌增加等[4]。此外,肠道菌群对肠道通透性的改变具有一定影响。正常生理环境下,不同菌群相互制约、互为依存,形成相对复杂的微生态系统。但在UC病理条件下,肠道通透性增高,肠腔内微生物进入肠粘膜固有层,破坏肠黏膜的免疫屏障作用,过度激活免疫系统,肠道免疫力降低。因此,UC遗传易感性的患者,其维持肠道微环境的能力往往较弱,肠道菌群状态不稳定。粪便微生物菌群移植(fecal microbiota transplantation,FMT)近年来已被用于多种与肠道菌群相关的疾病。临床结果显示,UC患者接受FMT治疗后,其症状缓解率显著高于安慰剂组,且未出现严重不良反应[31]。因此通过调控UC患者紊乱的肠道微环境是治疗UC的新型治疗手段。

本研究经菌群分析发现,UC小鼠肠道菌群多样性降低,健脾化湿方在一定程度上能改善和恢复菌群多样性。已有研究表明,与健康人群相比,UC患者厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门和Epsilonbacteraeota相对丰度显著提高,而拟杆菌门的相对丰度显著下降。在本研究中,模型组厚壁菌门、Epsilonbacteraeota和变形菌门显著升高,拟杆菌门显著下降,与上述临床结果一致。在属水平上,DSS诱导后,各组UC小鼠乳酸菌相对丰度均有所降低,健脾化湿方干预后,Akkermansia等益生菌比例有所上升。乳酸菌能调节肠道免疫平衡,抑制致病菌的黏附与侵袭,维护肠黏膜屏障稳定[32],而DSS诱导导致乳酸菌降低,削弱肠黏膜对各致病因素的防御作用。益生菌能够改善肠黏膜屏障和免疫系统功能,从而促进抗炎因子的分泌,抑制肠道中有害细菌的生长。益生菌也能够外源性地补充UC患者肠道中减少的菌群种类,改善和恢复肠道菌群平衡。Akkermansia是一个潜在的益生菌,能够抑制肠道炎症,促进局部炎症环境下肠上皮细胞的增殖和迁移,参与调节肠道黏膜的宿主免疫稳态,改善肠道屏障功能[33]。在本研究中,由于样本量较低,尽管试验结果显示健脾化湿方给药后能够在一定程度上改善和恢复菌群多样性,但该结果并未体现出显著性差异。因此,肠道菌群的变化趋势仅为我们下一步研究提供了方向与思路,需深入试验以精确找到具有生物学意义的差异菌群供后续分析,为健脾化湿方临床治疗UC提供进一步的实验依据。

综上,健脾化湿方可能通过调节肠道菌群组成,加快菌群恢复,改善菌群结构发挥治疗UC的作用,对于指导中药治疗UC具有重要意义。