FoxO转录因子参与糖尿病心肌病脂代谢研究进展

唐睿,汤依群

(中国药科大学基础医学与临床药学学院临床药学教研室,江苏 南京 211198)

糖尿病在全球的发病率和死亡率逐年升高。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病主要并发症之一,最初由Rubler发现,定义为排除冠状动脉疾病以及瓣膜性心脏病等因素由糖尿病独立引起的心肌结构和功能异常[1]。DCM患者大多最初表现为无明显症状的舒张期心功能受损但收缩功能保留的心功能障碍,进而最终发展为射血分数保留的心力衰竭(HF with preserved ejection fraction,HFpEF)[2]。糖尿病心肌病与早期心肌代谢紊乱密不可分。糖尿病心肌早期脂代谢异常包括前期糖异生增加、胰岛素抵抗引起机体内环境改变、心肌脂肪酸摄取与利用增加以及脂毒性产物累积等,这一系列过程会诱发系统性微血管内皮功能障碍从而导致心肌纤维化引发HFpEF[3]。叉头框转录因子O(Forkhead transcription factor O,FoxO)是叉头框转录因子(Forkhead transcription factor,FOX)家族的O亚组,首次在果蝇中发现,主要在维持组织稳态,抵抗衰老、调节自噬等方面发挥作用,与寿命延长、癌症、糖尿病相关[4]。近年来越来越多的研究显示FoxO通过调控脂代谢参与糖尿病心肌病的发生与发展。本文旨在总结FoxO参与糖尿病心肌病脂代谢的信号转导调控,为预防治疗DCM提供新的思路。

1 脂代谢异常诱发糖尿病心肌病

心脏主要利用脂肪酸其次是葡萄糖来获取能量,在正常心肌中约有40%～60%的线粒体ATP来自脂肪酸的氧化。心肌几乎不储存能量底物,必须从血液中连续获取。体循环中的游离脂肪酸(free fatty acid,FA)主要通过载脂蛋白形式输送到心脏[5]。脂肪酸通过脂肪酸转位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)或被动扩散进入心肌细胞,随后被酰基辅酶A合成酶(acyl-coenzyme A synthetases,ACS)活化为酰基辅酶A,并通过肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1,CPT-1)进入线粒体参与脂肪酸氧化[6]。过氧化物酶增殖体激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)α以及其共激活剂过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)也能促进脂肪酸的摄取和氧化[7]。糖尿病患者早期肝糖异生增加使血糖持续升高,心脏暴露于超量的脂肪酸和碳水化合物中引起心肌胰岛素抵抗,胰岛素抵抗进而引起心肌葡萄糖摄取减少脂肪酸摄取增加。在糖尿病心肌中脂肪酸氧化也有所增加,但是心肌脂肪酸摄取远大于脂肪酸氧化使得大量脂质沉积,并且脂肪酸氧化会抑制葡萄糖氧化,心肌代谢由糖代谢转向FA氧化降低心脏效率[8]。脂质大量累积还会产生毒性脂代谢产物如长链酰基辅酶A,长链酰基肉碱,神经酰胺,二酰基甘油和三酰基甘油等。心肌脂质累积以及过度使用脂肪酸氧化会产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)诱导的氧化应激破坏心肌细胞中的线粒体功能,这些脂质的积累通过破坏线粒体电子传递增加ROS使ATP合成速率受损,并且会诱发心肌细胞炎症、凋亡,促使心功能障碍[9-10]。脂肪酸堆积还会引起心肌细胞肥大并激发细胞内质网应激等其他应激反应,触发炎性介质和成纤维介质的释放,如白介素-6(interleukin,IL-6)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)等激活心脏间质和血管周围成纤维细胞,使心肌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积增加,并增加心室硬度的交联程度,形成心肌纤维化[11]。纤维化改变的程度与舒张功能障碍的严重程度直接相关,引起糖尿病心肌结构与功能病变,进而最终发展为射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)[11]。

2 FoxO的转录调控

FoxO家族在哺乳动物细胞中主要包含4种亚型,FoxO1/FKHR,FoxO3/FoxO3a/FKHRL1,FoxO4/AFX和FoxO6。四者共同包含一个相同的110个氨基酸的DNA结合域(DNA-binding domain,DBD),即Forkhead(FKH)域,与下游靶基因启动子结合,负责调控靶基因转录[12],除此之外FoxO序列中还包含核定位(nuclear localization signal,NLS)区域,核输出序列(nuclear export sequence,NES),以及转录激活域(transactivation domain,TA)来保障转录活性。除了FoxO6缺乏一个含磷酸化位点的高度保守区域[13],所有FoxO亚型都具有相对一致的结构域以及转录后修饰(post-translational modifications,PTMs)位点[14]。FoxO主要通过参与下游靶基因转录来参与到细胞增殖、自噬、凋亡、代谢和氧化应激反应[15-17]。

FoxO的转录后修饰(PTMs)是影响其转录活性的主要途径,主要包括磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化等,针对FoxO蛋白结构的不同位点氨基酸进行不同种类的PTMs会影响FoxO在细胞中的亚细胞定位、与DNA或其他调节因子结合、降解等过程[4]。其中对FoxO的基本调节途径为胰岛素信号介导的磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途径,其诱导FoxO磷酸化与14-3-3蛋白结合,产生的复合物转移到细胞质中,磷酸化的FoxO蛋白受到核排斥的负调节,转录活性降低。当Akt处于去磷酸失活状态时,FoxO蛋白停留在细胞核中并调节靶基因的表达[18-19]。此外,FoxO的转录活性也受到伴侣蛋白调节。伴侣蛋白(信号分子、转录因子和辅因子)与不同PTMs的FoxO结合参与FoxO介导下游靶基因的转录活性[20]。

3 FoxO引起DCM早期心脏脂代谢紊乱

在糖尿病状态下负责调控FoxO的PI3K/Akt通路活性通常下降,FoxO不受抑制进而能通过转录下游代谢相关基因参与DCM代谢紊乱,如血糖升高、血脂累积、脂肪酸利用增加等,而脂质积累以及脂肪酸氧化又会进一步促进心肌氧化应激,并且通过c-Jun N 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、Ste20样激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)等通路促进FoxO进入细胞核中转录,形成恶性循环(见图1)。

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图1 FoxO在糖尿病心肌病早期脂质代谢紊乱中的作用和调节。FoxO主要通过与脂质代谢相关的下游靶基因的转录参与脂毒性,并主要通过PI-3K/Akt、JNK和MST1途径进行调节

FoxO1会在高脂肪饮食诱导合并高血压的HFpEF小鼠心肌中诱发脂质积累[34]。心肌中的FA摄取主要通过CD36进行,在DCM中CD36的表达上调[35]。暴露于高棕榈酸水平的心肌细胞通过FoxO1/诱导性NO-合酶(iNOS)/CD36途径增加甘油三酯(TG)的摄取[36]。在禁食状态下,胰岛素分泌降低,FoxO1通过增加膜CD36含量来增加C2C12肌肉细胞的FA摄取和氧化[36-37]。在db/db小鼠肝脏中发现FoxO1与PPARγ均表达升高,PPARγ能增加脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport proteins,FATP)、CD36的表达增加脂肪酸摄取。在FoxO1腺病毒诱导的HepG2细胞中发现FoxO1与PPARγ启动子的结合,提高了PPARγ的mRNA表达水平[38]。高糖高脂诱导的血管内皮细胞中PPARγ1的K77位点类泛素样(small ubiquitin-like modifier,SUMO)修饰使其能更强地结合FoxO1,从而加重内皮胰岛素抵抗[39]。

3.2 FoxO促进心肌脂质摄取与脂肪酸氧化体循环中脂质累积为心肌摄取脂肪酸提供丰富来源。FoxO能通过结合到载脂蛋白C-Ⅲ(Apo C-Ⅲ)启动子上,促进Apo C-Ⅲ的表达,加重体循环中的甘油三酯(triglyceride,TG),可能促进了胰岛素抵抗状态下的高三酰甘油血症[29]。FoxO1能在胰岛素抵抗状态下转录3T3-L1脂肪细胞中的甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL),水解甘油三酯,释放FA进入体循环中,敲降FoxO1会降低ATGL的表达并且减少异丙肾上腺素刺激的脂解[30]。近年来有研究发现G0/G1开关-2蛋白(G0S2)能直接与ATGL结合,从而抑制ATGL水解脂肪,FoxO通过刺激ATGL并抑制肝脏中的G0S2表达增加甘油三酯分解[31-32]。不仅如此,FoxO1还能通过激活肝脏微粒体甘油三酯转移蛋白(microsomal TG transfer protein,MTP)转录增加体内VLDL。将FoxO1-RNAi递送到糖尿病db/db小鼠肝脏会引起FoxO1在肝脏中耗竭,导致MTP和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的产生减少[33]。

基于语篇衔接分析的定语从句教学主要是引导学生在认识到一般性代词和副词的照应手段的基础上，把握关系代词和关系副词对先行词的照应及其连接功能，在理解和认知上进行迁移学习。此种方法避免烦冗规则的死记硬背，更为重要的是培养学生的英语句子意识和语篇衔接意识。此种思路不仅仅可用于定语从句的语法知识教学，对于学生在写作中正确运用定语从句，增强语篇连贯意识也具有重要意义。

当明确导联错接类型后，就可以利用Einthoven三角定律纠正因肢体导联夹错接造成的异常肢导联心电图。依据前文推导，N导联夹错接上肢会打破Einthoven三角平衡，新形成的心电图无法通过导联夹互换或镜像改变而还原成正常导联连接状态的心电图。一旦发现这种心电图，必须重新作图。假设错接后的肢体导联为Ⅰ′、Ⅱ′、Ⅲ′、aVR′、aVL′、aVF′，则得出其余几种肢体导联错接的心电图快速调整方式如表3所示。

3.1 FoxO介导肝糖异生与胰岛素抵抗糖异生主要发生在肝脏代谢途径中,受胰岛素的严密调控。当肝脏胰岛素信号传导发生障碍时,糖异生作用增加,导致葡萄糖产生过多引起糖尿病空腹高血糖。大量研究认为FoxO1是介导胰岛素对糖异生作用的关键转录因子。在生理条件下胰岛素通过PI3K/AKT信号通路激活FoxO1磷酸化向胞浆移动,抑制糖异生的关键限速酶葡萄糖-6-磷酸激酶(glucose-6-phosphokinase,G6Pase)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)转录过程,调节生理状态下血糖下降[21]。而在糖尿病状态下胰岛素缺乏或胰岛素抵抗引起经典Akt通路下调,减少对FoxO1的抑制从而引起G6Pase与PEPCK转录导致血糖升高。除此之外,FoxO1本身转录增加也能增加肝脏中葡萄糖的产生。腺嘌呤核苷酸(AMP)可以通过抑制2型糖尿病db/db小鼠的组蛋白甲基化刺激肝FoxO1转录来增加肝糖合成[22]。但值得注意的是,肝脏中的FoxO1耗竭不会导致小鼠糖异生完全消除。有研究发现,与FoxO1不同,FoxO6因缺乏NES域的Akt磷酸化位点导致其无法在胰岛素刺激下进入到细胞质中,胰岛素能通过直接刺激FoxO6核内磷酸化改变其在细胞核内的构象,使其不能结合到下游靶基因启动子从而降低G6Pase以及PEPCK的转录活性来减少糖异生[23]。在胰岛素抵抗期间,FoxO6表达升高,并且有研究发现肝脏中FoxO6敲除小鼠还会出现空腹低血糖现象[24]。另外,FoxO3与FoxO4分别缺失的db/db小鼠无论是空腹血糖还是糖耐量与db/db小鼠相比都没有明显降低,FoxO1与FoxO3同时敲除的db/db小鼠虽然在一定程度上改善了肝糖升高但是也造成了脂肪合成增加[25]。针对FoxO不同亚型对糖异生的诱导还有待进一步探究。

FoxO家族也参与机体胰岛素抵抗。抑制肝脏中的FoxO1表达可以逆转肝脏胰岛素受体敲除(liver-specific disruption of the insulin receptor,LIRKO)小鼠的β细胞增生以减轻体内胰岛素抵抗[26]。同样,脂肪特异性胰岛素受体敲除小鼠表现出白色和棕色脂肪组织完全丧失,葡萄糖耐受不良,胰岛素抵抗,在此基础上再敲除此类小鼠脂肪中的FoxO1、FoxO3、FoxO4能够减轻这些症状[27]。在胰岛素抵抗的衰老大鼠和肥胖小鼠的肝脏中FoxO6表达升高。健康小鼠体内注射FoxO6等位基因(AdV-FoxO6-CA)腺病毒载体也同样出现胰岛素抵抗,并通过白介素1β(interleukin,IL-1β)促进肝脏炎症[28]。综上FoxO在代谢综合征前期能促进糖异生,并且诱导胰岛素抵抗。

除了通过上调CD36增加FA摄取,FoxO1还通过抑制C2C12细胞中乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA-carboxylase,ACC)表达,降低丙二酰辅酶A水平从而减少对β氧化的抑制[37]。心脏中的脂肪酸氧化也受PPARα转录调节[7]。最近有研究发现,在1型糖尿病小鼠心肌中的Krüppel样因子-5(KLF5)能直接结合PPARα启动子并激活其表达,而FoxO1能直接结合KLF5启动子促进心肌利用脂肪酸氧化[40]。FoxO1特异性缺失能够改善高脂诱导的心脏功能下降,保持了胰岛素反应性,并诱导了心脏代谢底物的偏好从脂肪酸到葡萄糖恢复。FoxO1过度活动通过刺激丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4)来限制线粒体葡萄糖氧化,在糖尿病心肌细胞中,活化PDK4还诱导脂肪酸的优先摄取和代谢转换[41],诱导心肌底物偏好转向脂肪酸代谢。FoxO在心肌中的表达增加了脂质摄取以及脂肪酸氧化,进一步加剧了脂质在心肌中的累积。

用微量移液管控制分取体积小于0.5mL，准确分取1.2中0、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00ng铼标准工作液于盛有1g氧化镁的坩埚中，90℃烘干，研为粉状，再加1g氧化镁，搅拌均匀，覆盖0.5g氧化镁，以下操作同1.4样品的处理，以铼的质量浓度为横坐标，质谱信号强度为纵坐标，绘制校准曲线a，用于测定铼质量分数低于10ng/g的样品。

3.3 FoxO参与脂毒性诱发心肌氧化应激与炎症心肌脂质累积会产生各种脂毒性中间体,如酰基肉碱,二酰基甘油和神经酰胺,在脂肪毒性心肌病、糖尿病和肥胖的各种啮齿动物模型中,已观察到心肌脂毒性中间体含量增加与心功能不全有关[42]。在心力衰竭患者体内植入左心室辅助装置通过AKT途径磷酸化FoxO,下调FoxO的表达,纠正了心肌胰岛素抵抗,并且降低了二酰基甘油和神经酰胺这类毒性脂质中间体水平的心肌水平从而改善心脏胰岛素信号传导[43]。心肌脂质堆积引起的脂毒性通过破坏线粒体电子传输产生大量ROS以及炎症,从而促进心肌大量损伤诱发心肌纤维化[8]。大量ROS以及炎症通过激活JNK以及MST1促进FoxO的核定位和激活。在ROS作用下,JNK与MST1能直接磷酸化并激活FoxO。这种磷酸化修饰破坏了FoxO与14-3-3蛋白的相互作用,从而使FoxO进入细胞核参与转录[44]。在2型糖尿病小鼠心脏和棕榈酸处理的新生大鼠心室肌细胞中产生大量ROS诱发MST1转录升高,FoxO3a能与MST1启动子结合并激活下游丝裂原活化蛋白激酶激酶1(MEKK1)/JNK级联反应,介导心肌脂毒性诱发心肌细胞凋亡并产生大量炎症[45]。在DCM中,饱和脂肪酸也可通过依赖于Toll样受体4(TLR4)诱导巨噬细胞分泌炎症介质如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β、IL-6和趋化因子配体2(chemokine C-C motif ligand 2,CCL2),维持心肌炎症[46]。在暴露于饱和脂肪酸棕榈酸酯或促炎细胞因子TNF-α培养的内皮细胞中FoxO1表达显著升高。针对高脂喂养小鼠的内皮细胞的FoxO敲除能改善肌肉炎症[47]。FoxO也参与到心肌脂毒性引发的氧化应激以及炎症。

4 总结与展望

DCM一直没有针对性药物,靶向代谢途径可能是未来治疗DCM的方向。近年来研究提示FoxO通过转录代谢相关靶基因调控脂代谢参与DCM的发生发展,部分研究提示抑制FoxO减轻代谢异常可能是治疗DCM的方向,并且针对此开发了FoxO抑制剂来改善代谢异常[48]。然而糖尿病患者大多会长期用药,有文献指出长期抑制FoxO会降低线粒体自噬可能会加速衰老并且增加肿瘤发病风险[49],长期抑制FoxO是否会带来风险也尚不明确,并且对于FoxO的上述讨论仍停留在临床前研究,糖尿病心肌病的具体机制以及FoxO转录因子在其中的作用在很大程度上还有待进一步研究。