LINC00152通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控LPS诱导小胶质细胞炎性反应的机制研究

刘新志 陈 臣 胡 燕 刘治艳 刘 涛

脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是脑卒中的危重类型,发生率、致残率及病死率均很高,且预后差[1]。迄今,ICH发病机制尚不明确,且缺乏有效临床治疗手段[2]。研究表明炎性反应在ICH后损伤是关键,小胶质细胞被认为是最早激活的炎症效应细胞,而PI3K/Akt/NF-κB与ICH后炎性反应密切相关[3～5]。非编码 RNA(ncRNA)是一类从基因组转录但不具蛋白表达功能的转录本,长度在200个核苷酸以上的被称为长链非编码RNA((long non-coding RNA,lncRNA)。lncRNA在神经系统中含量丰富,在神经系统疾病中发挥关键作用,参与脑损伤后血管再生、凋亡和炎症等过程,亦是预测ICH损伤程度的生物学标志物[6, 7]。课题组前期研究发现,lncRNA-LINC00152在神经系统疾病中有重要作用,而在ICH中未见报道,课题组预实验发现沉默LINC0152可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞炎性反应[8]。基于此,本研究以小胶质细胞为研究对象,诱导建立细胞炎症模型,使用反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)LINC00152,观察小胶质细胞表型、炎性因子及PI3K/Akt/NF-κB通路的变化,探讨其分子机制。此研究结果将为今后ICH的治疗提供实验基础及新药物靶点。

材料与方法

1.实验细胞及主要试剂与仪器:HMC3人小胶质细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司,细胞培养条件为MEM+10%FBS+1%PS,37℃、5% CO2、饱和湿度。胎牛血清(FBS)(上海依科赛生物制品有限公司,货号:FND500),MEM培养基(美国GIBCO公司,货号:FND500),胰酶(0.25% Trypsin-EDTA)(美国GIBCO公司,货号:25200-056),PBS磷酸盐缓冲液粉剂(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:ZLI-9062),TNF-α、IL-6、IL-1βELISA Kit、Anti-Human CD86 (B7-2) PE、Anti-Human CD206 (MMR) PE-Cyanine7均购自杭州联科生物技术股份有限公司,NOS试剂盒(南京建成生物科技有限公司,货号:A014-1),lncRNA ASO Negative Control、ASO-LINC00152购自广州锐博生物技术有限公司,PI3K(美国CST公司,货号:4249T),Akt(美国CST公司,货号:4691T),p-Akt(英国Abcam公司,货号:ab192623),NF-κB p65及Phospho-NF-κB p65(美国CST公司,货号:8242T、3033T),流式细胞仪(美国BD公司,货号:LSRFortessa),PCR仪(美国Bio-Rad公司,MyCycler Thermal Cycler)。

2.细胞转染及分组:利用lipo3000将100nmol/L riboTRACERTMFluorescent Oligo(指示剂)转染HMC3细胞。实验分为以下4组,即空白组(Control组):HMC3细胞正常培养72h;LPS组:HMC3细胞正常培养48h后,1μg/ml LPS干预24h;阴性对照组(LPS+ ASO-NC组):1μg/ml LPS提前1h干预,随后转染ASO-NC共同干预23h,换液后ASO-NC继续干预48h;LPS+ASO-LINC00152组:1μg/ml LPS提前1h干预,随后转染ASO-LINC00152共同干预23h,换液后ASO-LINC00152继续干预48h。转染后,去培养基,加1ml Trizol消化细胞,使Trizol平铺在细胞层面上,反复摇晃细胞培养瓶,直至细胞完全消化,置于1.5ml EP管中,备用。

3.流式细胞检测:取生长状态良好汇合率达90%的HMC3,用完全培养基制备成5×104cells/ml单细胞悬液,接种至6孔板中(2毫升/孔),培养过夜细胞贴壁后,按照上述实验方法进行干预;干预完成后,收集细胞,PBS重悬洗涤两次,离心,弃上清。加入PBS计数至1×107/ml,吸取100μl细胞悬液至流式管中,每管加入5μl CD86-PE、CD206 PE-Cy7抗体;4℃避光孵育20min,离心,弃上清,用400μl预冷的PBS重悬细胞,过200目无菌筛网;采用流式细胞仪检测CD86+(M1型)和CD206+(M2型)的比例。通过阴性样本管调整FSC、SSC电压及FSC阈值,使细胞群位于合适位置,圈目的细胞群,选择CD86-PE、CD206 PE-Cy7通道显示直方图,再调整相应荧光电压,使阴性细胞峰位于靠左荧光表达阴性区域内,沿阴性细胞群设门,对样本管进行上样;设门左边为荧光阴性表达比例,右边为荧光阳性表达比例。对CD86、CD206 阳性表达比例进行统计分析。

4.ELISA检测:取上述分组细胞上清液,检测TNF-α、IL-1β、IL-6含量,具体检测方法详见相关试剂盒。

5.iNOS 活性检测及:按上述实验方法进行干预后,收集细胞检测iNOS 含量,参考试剂盒相关方法。

6.RT-qPCR检测:按上述实验方法处理细胞,后续按照RT-qPCR实验报告操作。用TRLZOL试剂提取各组细胞总RNA,按5× All-In-One RT MasterMix(美国ABM公司,货号:G492)说明反转录得到cDNA,利用EvaGreen 2×qPCR MasterMix-Low ROX(美国ABM公司,货号:MasterMix-LR)及荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR分析。荧光定量PCR程序:95℃预变性10min;95℃变性15s,60℃退火/延伸60s,40个循环。采用GAPDH为内参,以2-ΔΔCt表示样品中目的基因相对表达量。实验重复3次。荧光定量mRNA检测引物信息详见表1。

表1 荧光定量mRNA检测引物信息表

7.Western blot法检测:按上述分组及方法处理完成后,收集细胞,PBS洗1遍后收集细胞。根据课题组前期实验方法进行Western blot法分析[9]。一抗孵育:PI3K(1∶800稀释)、Akt(1∶1000稀释)、p-Akt(1∶600稀释)、p65(1∶1000稀释)、p-p65(1∶800稀释)、β-actin(1∶1000稀释)。完后用 TBST 冲洗3次,再用HRP标记的二抗[兔抗(R)1∶5000,鼠抗(M)1∶15000]。采用 ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照。

结 果

1. 流式细胞检测:与Control组比较,LPS组、LPS+ASO-NC组和LPS+ASO-LINC00152组的CD86+表达差异有统计学意义(P<0.05);与Control组比较,LPS组和LPS+ASO-NC组的CD206+表达差异有统计学意义(P<0.05),而LPS+ASO-LINC00152组的CD86+表达差异无统计学意义(P>0.05)。与LPS组比较,LPS+ASO-NC组和LPS+ASO-LINC00152组的CD86+表达差异有统计学意义(P<0.05),LPS+ASO-LINC00152组的CD206+表达差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS+ASO-NC组比较,LPS+ASO-LINC00152组的CD86+、CD206+表达差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示,LPS+ASO-LINC00152组中CD86+(M1型)表达下调,而CD206+(M2型)表达上调(图1、图2)。

图1 流式检测细胞表面CD86+、CD206+比例

图2 流式检测CD86+、CD206+表达与LPS组比较,*P<0.05;与Control组比较,#P<0.05;与LPS+ASO-NC组比较,ΔP<0.05

2.ELISA检测:与Control组比较,LPS组、LPS+ASO-NC组和LPS+ASO-LINC00152组中TNF-α、IL-1β、IL-6比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+ASO-LINC00152组中的IL-6比较,差异有统计学意义(P<0.05),而TNF-α、IL-1β表达有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05,图3)。

图3 各组细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α检测结果与LPS组比较,*P<0.05;与Control组比较,#P<0.05

3.iNOS活性检测:与Control组比较,LPS组、LPS+ASO-NC组和LPS+ASO-LINC00152组中iNOS差异均有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+ASO-NC组和LPS+ASO-LINC00152中的iNOS表达差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS+ASO-NC组比较,LPS+ASO-LINC00152组的iNOS表达差异有统计学意义(P<0.05,图4)。

图4 各组中iNOS活性的水平与LPS组比较,*P<0.05;与Control组比较,#P<0.05;与LPS+ASO-NC组比较,ΔP<0.05

4.RT-qPCR检测:各组间PI3K、Akt、p65基因表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05,图5)。

5.Western blot法检测:各组间PI3K、Akt、p65表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与Control组比较,LPS组、LPS+ASO-NC组中p-Akt及p-p65差异均有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+ASO-LINC00152中的p-Akt及p-p65表达差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS+ASO-NC组比较,LPS+ASO-LINC00152组的p-Akt及p-p65表达差异有统计学意义(P<0.05,图6)。

图6 各组PI3K、Akt、p-Akt、p65、p-p65蛋白表达水平与LPS组比较,*P<0.05;与Control组比较,#P<0.05;与LPS+ASO-NC组比较,ΔP<0.05

讨 论

ICH发生后,小胶质细胞最先被激活,分泌大量的趋化因子、炎性因子、蛋白酶以及其他细胞毒性产物,增加血液中的炎性细胞聚集,导致炎症放大级联效应,从而加重神经损伤程度。活化的小胶质细胞具有两种表型(M1和M2型),M1型是可释放大量致炎性细胞因子,如IL-1β、TNF-α及活性氧等,损伤正常细胞及组织,而M2型释放一系列抗炎性细胞因子,如 IL-10 和转化生长因子-β,发挥神经保护效应,表型不同作用截然相反[10]。可见,小胶质细胞在ICH中具有双重作用,抑制其向M1表型转化或诱导其向M2表型转化,是抑制ICH后炎性反应改善预后的关键环节。

lncRNA在神经系统中含量丰富,在神经系统疾病中发挥关键作用,参与脑损伤后血管再生、凋亡和炎症等过程,亦是预测ICH损伤程度的生物学标志物[6,7]。LINC00152位于2p11.2染色体上,是一个lncRNA分子,有828个核苷酸,在多种人类组织中均有高表达,目前研究主要聚焦于肿瘤领域,在ICH中未见报道[11]。因此,本研究采用LPS诱导的小胶质细胞的炎症模型,模拟ICH后炎性反应,探索LINC00152在ICH中对小胶质细胞的影响。本研究发现ASO- LINC00152组在LPS诱导的小胶质细胞极化表型中CD86+(M1型)比例较低,而CD206+(M2型)比例较高,提示ASO- LINC00152可能使LPS诱导的小胶质细胞极化表型由M1型向M2型转化。同时,ASO-LINC00152有明显抑制了IL-6、TNF-α、IL-1β炎性细胞因子表达趋势,可作为ASO-LINC00152抑制小胶质细胞极化M1表型转化的佐证。然而,缺乏对M2表型转化时产生的抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的检测,是本实验的局限性。

本研究发现,ASO- LINC00152调控PI3K/Akt/NF-κB通路抑制炎症,基于抑制LPS诱导的小胶质细胞中p-Akt、p-p65蛋白表达。ICH后脑损伤是由多种基因和信号通路参与的复杂病理生理过程,包括炎症、氧化应激、神经细胞毒性、凝血酶形成等多方面,尤其是PI3K/Akt/NF-κB通路[12,13]。PI3K/Akt/NF-κB广泛存在于神经细胞中,且参与介导炎性反应,该通路激活可以改善ICH后神经元凋亡及神经炎症[5]。异丙酚可通过调节PI3K/Akt/NF-κB通路减轻ICH后的炎症性脑损伤[14]。研究显示,PI3K/Akt也参与了小胶质细胞炎性反应的调控[15,16]。脑缺血再灌注损伤中,红景天苷调控了p-Akt与总Akt的比值,增加神经元核蛋白,减少梗死周围区域小胶质细胞,发挥抗炎保护神经元的作用[17]。此外,LPS可刺激小胶质细胞大量表达炎性细胞因子和趋化因子,E3泛素连接酶c-Cbl可以通过调节PI3K/Akt/NF-κB通路,抑制小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症,起到脑保护作用[18]。本研究ASO- LINC00152调控PI3K/Akt/NF-κB通路在LPS诱导的小胶质细胞炎症模型中发挥抗炎作用,与同行研究结论一致。

综上所述, LINC00152在神经炎症中具有一定的作用,与PI3K/Akt/NF-κB信号通路关系密切。沉默LINC00152通过调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路,可能使LPS诱导的小胶质细胞表型发生改变,减少炎性因子释放,从而发挥抑制炎性反应的作用。本研究可为今后ICH的治疗提供实验基础及新药物靶点。