柚皮素缓解干眼病引起的角膜疼痛综合征的机制研究

印健，顾宇亮

（江苏省昆山市中医医院眼科，江苏昆山 215300）

干眼病（dry eye disease，DED）是眼科常见的眼表和泪液疾病，伴有神经感觉异常[1-2]，以眼部干涩、异物感、烧灼感、瘙痒和疼痛等症状为主要临床表现[3]。角膜为透明的无血管组织，是机体神经分布最密集的组织[4]。角膜伤害性神经支配为睫状神经，其中，神经元位于三叉神经节（TG）的眼支中[5-6]。三叉神经节是口腔颌面部从外周到中枢神经系统疼痛传递和疼痛调节的关键部位[7]。不同类型的受体（机械伤害感受器、多模态伤害感受器和温度感受器）共存于单个角膜神经末梢上[8]，大约40%是多模态伤害性感受器，对热、酸和化学试剂敏感，50%是冷的温度感受器，10%是机械伤害感受器[9]。有害的（包括热、机械、化学）刺激和炎症可以诱导干眼病角膜感觉神经元终端激活，导致痛觉增强[8]。

目前，人工滴眼液和环孢霉素是干眼病的主要治疗方法[10-11]。虽然这些干预措施已被广泛应用于缓解眼部症状，但通常只对轻度干眼病症状提供短期缓解，对中度至重度干眼病症状无效。因此，有必要探寻更优的干预措施和药物。近年来，一些植物化学物质因具有较强的抗氧化、抗炎功能有助于减轻干眼病症状，且副作用和毒性小，因此受到特别的关注。化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis“Tomentosa”或柚Citrus grandis（L.）Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，有散寒、燥湿、消痰、利气等功效，用于风寒咳嗽、喉痒痰多、食积伤酒、呕恶痞闷等症。柚皮素（naringenin，NAR）是来源于化橘红的一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、镇咳以及抗癌等多种药理活性，其目前已成为眼病治疗的热点之一[12-13]。

趋化因子13（CXCL13），也被称为B 淋巴细胞螯合剂，最初在B 细胞滤泡的基质细胞中被发现，可调节B 细胞和T 细胞亚群的归属[14]。既往研究表明，CXCL13 在正常中枢神经系统中不表达，但在某些病理条件下在大脑和脊髓中呈高表达[15-16]。另外，Colafrancesco 等[17]发现，CXCL13能够作为干燥综合征（Sjögren’s syndrome）组织学病变的生物标志物。因此，本研究以CXCL13为切入点，旨在探讨柚皮素对干眼病引起的角膜疼痛综合征的缓解作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24 只清洁级8 周龄成年雄性C57BL/6 小鼠，体质量（23.48±0.04）g，购自无锡恒泰实验动物养殖有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2023-0005，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2023-0006。小鼠被随机分配到笼子里（6 只/笼），并在受控条件下维持温度（22 ± 1）℃，相对湿度（60 ± 10）%，12 h/12 h 光/暗周期，自由进食和饮水。所有的动物实验程序都严格按照江苏省昆山市中医医院批准的实验动物护理和使用机构指南进行，动物伦理审批号（院科伦审：AEWC-2010293）。

1.2 药物、试剂与仪器

柚皮素（NAR，分子式：C15H12O5，分子量：272.25，分子式见图1）购自北京索莱宝科技有限公司，CAS 号：480-41-1，纯度≥98%。泪腺凝胶（英国Dechra 公司）；MinuteTM总蛋白提取试剂盒（美国Invent Biotechnologies 公司）；SYBR Green PCR Master Mix（日本TaKaRa公司）；CXCL13 抗体、GAPDH 抗体、IgG 二抗（美国Abcam 公司）；c-FOS抗体（美国Santa Cruz公司）。Alcon Ⅱ电子显微镜（德国Leica公司）；BX51显微镜（日本Olympus公司）；NanoZoomer2.0-HT 数字切片扫描设备（日本Hamamatsu Photonics 公司）；Rotor-Gene 6000 荧光定量PCR仪（德国Hamburg 公司）；ScanLater Western Blot检测系统（美国Bio-Rad 公司）。

图1 柚皮素分子结构Figure 1 Molecular structure of naringenin

1.3 分组与造模

将24 只小鼠随机分为4 组：sham 组（假手术对照组）、DED 组（干眼病模型组）、DED+DMSO 组（治疗对照组）、DED+NAR 组（柚皮素治疗组）。每组6 只。

DED 组小鼠处理方法如下：腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）麻醉小鼠，进行单侧（右侧）眶外泪腺（ELG）和哈德氏腺（HG）切除。手术前，在两只眼睛上均滴一滴泪腺凝胶。在手术显微镜下，在颞侧做一个8 mm 的皮肤切口，暴露并切除眶外泪腺。在分离眼眶上方靠近内眦的结膜组织后，小心地取出哈德氏腺。通过检查手术区是否有任何残留的腺体组织来验证是否完全切除。然后使用6.0 编织丝线缝合皮肤切口。在切口处滴上一滴碘酒溶液，以避免细菌感染。根据眼睑闭合时间及角膜机械阈值判断造模是否成功。对于sham 组小鼠：在同一区域做一个切口，但不接触腺体。小鼠被放置在温暖（30 ℃）的笼子里，以便从手术中恢复。

DED+DMSO 组及DED+NAR 组小鼠处理步骤如下：在手术前，使用柚皮素进行眼局部治疗。从手术后第7 天开始，只在右眼进行DMSO 溶剂（DED+DMSO 组）或1%柚皮素（DED+NAR组，柚皮素溶于DMSO，滴入剂量为50 μL）眼部局部滴注，持续到第21 天。DED 小鼠每天在笼子里接受2 次治疗（上午10 点和下午5 点）。此外随机排列笼子顺序，以进行眼部局部滴注。所有测试都在第21 天进行。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 行为测试

首先进行行为测试。对于行为测试，实验开始前30～60 min，将小鼠放置在测试室。

1.4.1.1 角膜对化学和机械刺激敏感性的测量

将1%柚皮素应用于右眼后，立即将动物放入单独的笼子中，通过测量5 min 内右眼眼睑的闭合时间长度检测角膜的化学敏感性。使用Von Frey纤维丝测痛仪检测机械角膜敏感度[18]。将经过校准的Von Frey 细丝（0.008～0.04 g）的力施加到被固定小鼠的角膜中心。机械阈值与眨眼反应相对应。

1.4.1.2 高架十字迷宫试验

将动物置于高架十字迷宫的中心区域，使其头部朝向闭合臂，开启摄像监控器记录5 min 内小鼠在开放臂中花费的时间。使用Smart 3.0 软件（Harvard Apparatus）分析行为参数。

1.4.1.3 黑白箱试验测试焦虑

测试装置由一个盒子组成，盒子分为一个小（三分之一）暗室和一个大（三分之二）明亮的照明室。将小鼠放入照明的隔间中，并允许在两个室之间自由移动。进入暗室的第1个潜伏期和在亮室中花费的总时间是小鼠明亮空间焦虑的指标。测试前，小鼠适应实验室至少60 min。使用视频跟踪系统，并用Smart 3.0 软件（Harvard Apparatus）分析行为参数。在动物实验之间，用70%乙醇清洁试验箱的地板和墙壁，以避免任何干扰。

1.4.2 c-FOS检测

小鼠被安乐死后，解剖取脑，采集杏仁核，固定，脱水、石蜡包埋和制片。脱蜡和水化，抗原修复，消除内源性过氧化物酶活性，用5%正常山羊血清孵育30 min。然后加入c-FOS 抗体（1∶200）4～ 8 ℃孵育48 h，PBS 洗涤后，加入生物素化山羊抗兔二抗（1∶200）中孵育2 h，再次PBS 洗涤，放入亲和素-生物素-过氧化物酶复合物溶液中60 min。最后，二氨基联苯胺（DAB）用于可视化c-FOS 免疫反应性，PBS 洗涤终止显色，脱水，封片。使用Olympus BX51 显微镜对切片进行扫描，借助图像分析系统，对c-FOS阳性细胞进行计数。

1.4.3 睫状神经纤维自发和受激活动的多单位细胞外记录

自发性睫状神经纤维活性在第21 天测定。小鼠被安乐死后，迅速摘下右眼（手术侧）。在（33 ±1）℃和pH 7.4 的条件下，用超灌注生理盐水对角膜进行基线记录。本研究对睫状神经的诱发活动是在热刺激下测量的，在pH 7.4 下将超融合盐水的温度从（33±1）℃降至（20±1）℃（冷刺激）或高达（40±1）℃（热刺激）。使用吸引电极（Ag/AgCl）记录睫状神经的多单位细胞外电活动。信号被滤波（300～5 000 Hz）放大（×10 000），并通过Spike 2数据分析软件（CED Micro1401，Cambridge Electronic Design）以10 000 Hz 的采样频率数字化。在进行电生理记录之前，将角膜与超融合生理盐水溶液超融合30 min 以稳定准备。自发性细胞外睫状神经纤维活动定义为每秒脉冲（imp/s）。

1.4.4 RT-qPCR分析

使用TRIzol 试剂提取三叉神经节（TG）的总RNA。逆转录后，应用SYBR Green PCR Master Mix 在荧光定量PCR 仪中进行qPCR 分析。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成，引物序列如下：CXCL13 Forward：5’-GGCCACGGTATTCTGG AAGC-3’，Reverse：5’-ACCGACAACAGTTGAA ATCACTC-3’。IL-1β Forward：5’-ACTCATTGT GGCTGTGGAGA-3’，Reverse：5’-TTGTTCATCTC GGAGCCTGT-3’。IL-6 Forward：5’-CTGCAAGAG ACTTCCATCCAG-3’，Reverse：5’-AGTGGTATAG ACAGGTCTGTTGG-3’。IL-10 Forward：5’-GCTCT TACTGACTGGCATGAG-3’，Reverse：5’-CGCAGC TCTAGGAGCATGTG-3’。GAPDH Forward：5’-GC TTGAAGGTGTTGCCCTCAG-3’，Reverse：5’-AG AAGCCAGCGTTCACCAGAC-3’。扩增长度均为200 bp。PCR反应条件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃45 s，40个循环。GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

1.4.5 Western Blot 法检测三叉神经节CXCL13表达水平

使用MinuteTM总蛋白提取试剂盒提取三叉神经节总蛋白。用二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。然后，将等量的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。将凝胶中分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，将膜与一抗CXCL13（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）孵育过夜。洗膜后在室温下与IgG 二抗（1∶5 000）孵育1 h。洗膜后，用增强化学发光试剂（ECL）试剂盒显色，以Western Blot 检测系统检测，用ImageJ 软件对灰度图进行半定量分析。GAPDH 为内参。

1.5 统计方法

采用SPSS 21.0 统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示。2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），事后检验采用Tukey’s 多重比较法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干眼病诱导小鼠化学和机械性角膜过敏和焦虑样行为

模型组小鼠的眼睑闭合时间较sham 组显著增加（P＜0.01），见图2-A。与sham 组比较，模型组小鼠的角膜机械阈值显著降低（P＜0.01），见图2-B。本研究使用2 种行为测试来检验小鼠焦虑状态，高架十字迷宫结果显示：模型组小鼠开臂停留时间较sham 组显著降低（P＜0.01），见图2-C；黑白测试结果显示，模型组小鼠在白色区域花费的时间同样显著低于sham组（P＜0.01），见图2-D。杏仁核在慢性焦虑和疼痛的发展中起着重要作用。本研究观察了干眼病小鼠大脑杏仁核中c-FOS免疫反应性（神经元激活的标志）的变化，结果显示，模型组小鼠杏仁核中cFOS 阳性细胞数量高于sham组（P＜0.05），见图2-E。

图2 干眼病诱导小鼠化学和机械性角膜过敏和焦虑样行为Figure 2 DED induces chemical and mechanical corneal allergy and anxiety-like behaviour in mice

2.2 柚皮素减轻干眼病引起的角膜疼痛综合征

评估柚皮素对干眼病的治疗效果，结果显示，DED+NAR 组干眼病小鼠眼睑闭合时间显著降低，角膜机械阈值增加，与DED+DMSO 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），见图3-A～B。同时，使用柚皮素治疗减少干眼病小鼠角膜伤害感受器敏化，具体表现在对热和冷触发的角膜神经活动的作用。结果显示，于20、31、40 ℃，DED+NAR 组小鼠睫状神经的诱发活动较DED+DMSO 组显著下降（P＜0.01），见图3-C。以上结果表明，柚皮素可减轻干眼病引起的角膜疼痛综合征。

图3 柚皮素减轻干眼病引起的角膜疼痛综合征Figure 3 Naringenin alleviates corneal pain syndrome caused by dry eye disease

2.3 柚皮素减少干眼病小鼠角结膜促炎细胞因子

本研究通过RT-qPCR 法检测不同处理组小鼠角结膜炎症因子的表达水平，结果如图4所示：与sham 组比较，DED 组小鼠角结膜中促炎症因子IL-1β mRNA、IL-6 mRNA水平显著上升，抗炎症因子IL-10 mRNA 水平显著下降（均P＜0.001）；与DED+DMSO 组比较，DED+NAR 组角结膜上述炎症因子mRNA 表达水平均出现显著逆转（均P＜0.01）。

图4 柚皮素减少干眼病小鼠角结膜促炎细胞因子Figure 4 Naringin reduces pro-inflammatory cytokines in the cornea of mice with dry eye disease

2.4 柚皮素降低干眼病小鼠三叉神经节CXCL13 mRNA及蛋白表达水平

为探讨柚皮素是否通过调节CXCL13 表达缓解干眼病小鼠角膜疼痛，本研究通过RT-qPCR 法检测CXCL13 mRNA 表达水平，Western Blot 法检测CXCL13 蛋白表达水平。图5 结果显示，DED 组小鼠CXCL13 mRNA 及蛋白表达水平均较sham 组显著上升（P＜0.001），而DED+NAR 组CXCL13 mRNA 及蛋白表达水平均低于DED+DMSO 组（P＜0.01或P＜0.001）。

图5 柚皮素降低干眼病小鼠三叉神经节CXCL13 mRNA及蛋白表达水平Figure 5 Naringin reduces mRNA and protein expression levels of CXCL13 in the trigeminal ganglion of mice with dry eye disease

3 讨论

干眼病是一种常见的眼部疾病，包括由于眼表炎症引起的不适、视力障碍和泪膜渗透压增加等多种症状[19]。目前，干眼病机制尚不完全明确。在干眼病中，泪腺和眼表面的稳态维持丧失，使稳定泪膜和保护眼表面的泪膜成分失衡[20-21]。泪液高渗是干眼恶性循环的中心事件之一，导致泪液减少，促进促炎细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达和生成[20]。本研究中，柚皮素降低了干眼症小鼠促炎因子IL-1β、IL-6 mRNA 水平，升高了干眼症小鼠抗炎症因子IL-10 mRNA 水平，表明干眼症小鼠经柚皮素治疗后炎症反应下降。

角膜超敏性、炎症和自发角膜神经纤维活动之间存在一定的联系[22]，角膜炎症参与角膜神经感受器的激活[23]。趋化因子被认为在神经病理性疼痛的发病机理中起着关键作用[23]，包括CCL2、CCL7、CXCL1 和CXCL13 在内的几种趋化因子[24-25]。有研究报道，10种趋化因子（包括CCL2、CCL7、CXCL1和CXCL13）在脊神经结扎后的脊髓中表达增加了3 倍以上，其中，CXCL13 是上调最多的基因，增加了47 倍[25]。本研究结果显示，干眼病小鼠三叉神经节CXCL13 mRNA 及蛋白表达水平也显著上调，而柚皮素对CXCL13 mRNA 及蛋白表达水平有一定的抑制作用。

临床前研究和临床研究报告了干眼病角膜疼痛与焦虑共病[26]。本研究使用高架十字迷宫和黑白箱试验对DED 小鼠进行焦虑测试，结果显示，DED 小鼠出现焦虑行为。这种行为与杏仁核中观察到的神经元激活有关，使痛觉反应与疼痛的情绪方面之间建立联系。该发现强调了干眼病对动物神经精神的影响，将会导致疼痛和焦虑。而柚皮素可减轻干眼病引起的角膜疼痛综合征。

综上所述，本研究初步探究了柚皮素对干眼病小鼠化学和机械性角膜过敏、焦虑样行为以及三叉神经节CXCL13 mRNA 及蛋白表达水平的影响。柚皮素可抑制三叉神经节CXCL13表达，从而缓解干眼病引起的角膜疼痛综合征。