盐菟丝子炮制工艺优化

李雅娟，李 芳，李 凡，李莎莎，毛阿娟，陈 曦，韩 昕，王卫锋*

［1.树兰（安吉）医院 科教科, 浙江 湖州 330523； 2.陕西省中医药研究院 中药研究所, 陕西 西安710003； 3.陕西中医药大学 药学院 ，陕西 咸阳 712046］

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australisR.Br.或菟丝子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟种子，具有补益肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻之功效[1]。2020 年版《中国药典》收录菟丝子、盐菟丝子两种规格，其中临床使用以盐菟丝子为主。研究发现，菟丝子盐炙后不温不寒、平补阴阳，能引药入肾，增强其补肾固涩的作用[2]。

菟丝子盐制首载于宋代《圣济总录》，参照2020 年版《中国药典》和部分地方饮片标准时发现，菟丝子盐炙记载仅对炮制用盐量、火候、食盐溶解方法作了规定，没有明确的盐水用量、炒制温度、炒制时间，具体工艺多以经验控制为准，缺乏规范的炮制工艺参数，且此前文献盐炙工艺优选多采用正交实验的方法获取[3]，评价指标单一，设计简单，试验精密度不高[4]。故本研究选盐水量、炒制时间、炒制温度为考察因素，以菟丝子中绿原酸、金丝桃苷、紫云英苷、山柰酚、总黄酮、浸出物及脂肪油的含量为指标，结合响应面法及综合评分优选菟丝子盐炙工艺，为盐菟丝子工业化大生产提供参考。

1 仪器与材料

ACQUITY 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；日立U-2910 型紫外可见分光光度计［日立科学仪器（北京）有限公司］。

紫云英苷（批号：PS011379，纯度≥98%；成都普思生物科技股份有限公司），绿原酸（批号：HC021133， 纯 度≥98 %）、 金 丝 桃 苷（ 批号：HH084345，纯度≥98%）、山柰酚（批号：HK201888，纯度≥98%）均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司。

甲醇、乙腈［色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；磷酸（色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；氢氧化钠（粒）、亚硝酸钠、硝酸铝（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）；食盐（未加碘精制盐，批号：202203，湖北长舟盐化有限公司）。

实验选择自采菟丝子（宁夏银川通贵区，批号：20220425，寄主植物：大豆）为实验药材，经陕西省中医药研究院杨智峰研究员鉴定为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australisR.Br.的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 4 个指标成分的含量测定

2.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm,1.7 μm），乙腈（B）- 0.1%磷酸水（D）为流动相进行梯度洗脱（0 ～ 10 min，10% →18% B；8 ～ 12 min，18%→30% B；12 ～ 15 min，30%→38% B；15 ～ 17 min，38%→10% B；17 ～ 20 min，10% B），进样量为1 μL，流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为350 nm，在该条件下进样，结果见图1，各成分与相邻峰均能有效分离。

图1 UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatogram

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、金丝桃苷、紫云英苷、山柰酚、对照品适量，分别置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成 浓 度 分 别 为300.0 μg/mL、318.2 μg/mL、282.1 μg/mL、350.0 μg/mL 的标准对照品母液。分别取上述母液2.50 mL、3.30 mL、1.95 mL、0.50 mL 于同一10 mL 容量瓶中，制成每1 mL 分别含绿原酸、金丝桃苷、紫云英苷、山柰酚75 μg、105 μg、55 μg、

17.5 μg 的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取菟丝子粉末（过4号筛）1.0 g，精密称定，置100 mL 锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，称重，超声30 min，取出，摇匀，静置，用80%甲醇溶液补足失重，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 分别置于6 个10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成不同质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样1 μL 进行色谱分析。以各成分峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，对数值进行线性回归，可见各成分在相应线性范围内有良好的线性关系。将混合对照品逐级稀释，分别以S/N=3 和S/N=10时计算检测限和定量限，结果见表1。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationship of each component

2.2.2 精密度实验 取“2.1.2”项下混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样6 次，计录4 种成分峰面积，计算得1 ～ 4 各成分峰面积RSD 分别为1.65%、0.54%、0.75%、0.58%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 精密吸取“2.1.3”项下供试品溶液适量，室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h，在“2.1.1”项色谱条件下进样，测得1 ～ 4 各成分峰面积RSD 分别为1.08%、1.23%、1.48%、1.32%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.2.4 重复性试验 精密称取同一供试样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，平行6 份，在“2.1.1”项下色谱条件测定，计算得1 ～ 4 各成分平均含量分别为0.078 7%、0.118 1%、0.112 1%、0.038 0%，RSD 分别为0.48%、0.77%、0.77%、1.22%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验 称取同一批菟丝子药材粉末约0.5 g，精密称定，平行取6 份，分别精密加入已知浓度的各对照品溶液（与菟丝子药材粉末中各成分含量相近），按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样，进行测定，计算各成分加样回收率及RSD，结果见表2。

表2 加样回收率实验结果（n = 6）Tab.2 Results of dosing recovery (n = 6)

2.3 菟丝子总黄酮含量测定

参照杨颂等[5]的方法，制备金丝桃苷对照品溶液、菟丝子供试品溶液，在500 nm 波长下测定吸光度。结果显示回归方程为A= 0.014 7C- 0.014 3（C为金丝桃苷浓度，A为吸光度值），r= 0.999 8，金丝桃苷在5.31 ～ 53.1 μg/mL 范围内呈良好线性关系；精密度试验RSD 值为0.94%，表明仪器精密度良好；稳定性试验RSD 值为2.76%，表明供试品溶液在90 min 内稳定性良好；重复性试验RSD 值为0.82%，表明方法重复性良好；加样回收率结果见表3，平均回收率为98.62%，RSD 值为1.79%。

表3 总黄酮加样回收率试验结果（n = 6）Tab.3 Total flavonoid dosing recovery results (n = 6)

2.4 浸出物含量测定

参照2020 年版《中国药典》（四部）通则2201浸出物测定项下的热浸法测定[6]。其中醇溶性浸出物测定时选择60%乙醇为溶剂。

2.5 脂肪油含量测定

参照文献[7]的测定方法。

2.6 综合评分计算公式的确定

根据各部分对菟丝子及盐菟丝子药效发挥的贡献及各成分的含有量多少，分别赋予各指标成分权重系数[8-9]。采用综合加权评分法评估菟丝子盐炙工艺。将总黄酮、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、脂肪油的权重系数设为0.2、0.2、0.2、0.1，4 个指标成分权重系数分别设为0.06、0.12、0.06、0.06。即综合评分=（绿原酸含量/绿原酸最大含量）×100×0.06 +（金丝桃苷含量/金丝桃苷最大含量）×100×0.12 +（紫云英苷含量/紫云英苷最大含量）×100×0.06 +（山柰酚含量/山柰酚最大含量）×100×0.06 +（总黄酮含量/总黄酮最大含量）×100×0.2 +（水溶性浸出物含量/水溶性浸出物最大含量）×100×0.2 +（醇溶性浸出物含量/醇溶性浸出物最大含量）×100×0.2 +（脂肪油含量/脂肪油最大含量）×100×0.1。

3 单因素考察

3.1 盐水用量考察

综合文献及预实验实际测定，称取生品菟丝子五份，每份100 g，置密闭容器中，分别加入30、40、50、60、70 mL 盐水（均含食盐2 g），拌匀，闷润2 h，待炒制容器内温度达到120℃时倒入，炒制4 min。取出晾凉晾干，筛去碎屑，粉碎，备用。依据总黄酮、浸出物、脂肪油及金丝桃苷、绿原酸、紫云英苷、山柰酚含量测定结果，计算综合评分，结果见表4、图2。根据评分结果选择后续盐水用量30 ～ 50 mL。

表4 菟丝子盐炙工艺单因素考察结果Tab.4 Results of single-factor investigation of Cuscutae Semen salt burning process

图2 盐水用量（A）、炒制温度（B）和炒制时间（C）对综合评分的影响Fig.2 Effects of brine dosage (A), stir-frying temperature (B) and stir-frying timeon (C) the overall score

3.2 炒制温度考察

称取生品菟丝子五份，每份100 g，置密闭容器中，加入40 mL 盐水（含食盐2 g），拌匀，闷润2 h，待炒制容器内温度分别达到100、110、120、130、140℃时倒入（每个数值代表温度范围的下限，即100℃代表100 ～ 110℃的温度范围），炒制4 min。取出晾凉晾干，筛去碎屑，粉碎，备用。依次测定各指标，计算综合评分，结果见表4、图2。根据评分结果选择炒制温度100 ～ 140℃。

3.3 炒制时间考察

称取生品菟丝子五份，每份100 g，置密闭容器中，加入40 mL 盐水（含食盐2 g），拌匀，闷润2 h，待炒制容器内温度达到120℃时倒入，分别炒制3、4、5、6、7 min。取出晾凉晾干，筛去碎屑，粉碎，备用。依次测定各指标，计算综合评分，结果见表4、图2。根据评分结果选择炒制时间3 ～ 7 min。

4 响应面法优化盐炙工艺试验

4.1 响应面实验设计

同样以综合评分为评价指标，考察盐水用量、炒制温度、炒制时间对菟丝子盐炙工艺的影响，基于单因素设计Box-Behnken 响应面试验，试验因素与水平见表5。取同一批菟丝子饮片17 份，每份100 g，依据各指标成分、总黄酮、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、脂肪油含量测定结果，计算综合评分，结果见表6。

表5 盐炙菟丝子响应面试验设计因素水平表Tab.5 Level table of experimental design factors of salt burning Cuscutae Semen response surface

表6 盐炙菟丝子响应面实验设计及结果Tab.6 Experimental design and results of salt burnt Cuscutae Semen response surface

4.2 结果分析

利用Design Expert 10 软件对实验结果数据进行拟合分析，得二次多项式方程为Y= 88.62 + 0.43A-0.47B+ 0.48C+ 0.39AB+ 0.96AC- 0.73BC- 2.55A2-3.27B2- 2.82C2。方差分析结果见表7，拟合得到二项式模型P＜0.000 1，极具显著性，失拟项P= 0.498 2（＞0.05）不显著。说明在研究范围内所建模型具有统计学意义。单因素B（炒制时间）、C（炒制温度）均极具显著性。根据F值可知各因素贡献率为C＞B＞A。模型相关系数R2= 0.985 7，决定系数R2Adj= 0.965 4，可预测89.22%响应值。说明该模型拟合良好，可用于菟丝子盐炙工艺优化。

表7 回归模型方差分析结果Tab.7 Results of ANOVA of regression models

绘制个各因素对盐炙菟丝子综合评分的影响的响应曲面图及单因素两两交互作用图，结果见图3。其中，曲面越陡峭，等高线越密集，说明该因素对综合评分的影响越显著[10]。

图3 盐水用量、炒制时间、炒制温度两两交互对盐菟丝子综合评分的影响Fig.3 Effects of salt water dosage, stir-frying time and stir-frying temperature on the comprehensive score of salt Cuscutae Semen

从图3 结合方差分析可知，炒制时间（B）和炒制温度（C）所对应的曲面最陡峭，表明两者对菟丝子盐炙工艺影响最显著，且两者交互影响最显著。根据回归模型预测，菟丝子最佳盐炙工艺为：每100 g菟丝子加盐水41 mL，炒制时间为4.84 min，炒制温度为122.27℃。根据实际操作，将预测所得最佳进行调整，即：每100 g 菟丝子加盐水40 mL,炒制温度为120 ～ 130℃，炒制时间为5 min。

4.3 工艺验证

按最佳条件进行3 次验证试验，同样测定各指标成分的含量，计算综合评分，结果见表8。验证实验平均综合评分为90.270 1，与预测值88.683 3 之间的相对误差为1.76%，与预测结果相近，表明本实验所建模型预测能力较强，形成的盐炙工艺稳定性较好。

表8 盐菟丝子最优工艺验证（n = 3）Tab.8 Verification of optimal process of salt Cuscutae Semen（n = 3）

5 讨论

研究发现，菟丝子中金丝桃苷、山柰酚、紫云英苷具有促进免疫调节[11]、促进神经干细胞增殖[12]、成骨细胞分化等作用；绿原酸具有增强免疫力、抗菌抗病毒的作用[13]；其总黄酮对人体生殖系统、心脑血管系统、免疫系统等均具有调节作用[14]；水溶性浸出物符合中医临床应用习惯；醇提物具有抗氧化、抗衰老、抗癌等作用[15-16]；且菟丝子含有一定量的脂肪油，研究表明脂肪酸有抗动脉硬化、预防心血管疾病的作用[7]。实验将其作为菟丝子盐炙工艺的评价指标，使优化所得工艺更加贴合临床。

实验前期对菟丝子总黄酮含量进行测定时，因菟丝子中基本不含芦丁，选用金丝桃苷为对照品，使总黄酮含量测定结果更为合理。在优化菟丝子盐炙工艺时，加入炮制辅料食用盐的考察，对不同来源食盐对盐菟丝子中各部分含量的影响作了比较研究，结果显示不同来源食盐其综合评分相近，但实验并未对盐菟丝子中食盐进行测定，后续将对炮制用盐的选择进行更为细致的研究。

炒制时间考察实验结果可以看出，盐菟丝子综合评分在7 min 时急剧下降，其可能原因有，菟丝子种子细小，炒制时间过长，容易炒僵，受热过长导致有效成分破坏，含量降低，且种皮大面积破裂，将导致菟丝子脂肪油含量流失严重，综合评分降低。且响应面实验结果表明，盐炙过程中，炒制温度和炒制时间对菟丝子盐炙方法影响较大，可能是菟丝子经加热处理后，质地酥脆，其黄酮类成分溶出增加，含量升高。这与张颖等[17]实验结果较为一致，可互为印证。

6 结论

本研究通过单因素结合响应面，多指标综合评分评估优化菟丝子盐炙工艺，经验证优选工艺稳定可行，可为规范化生产盐菟丝子提供参考。但工艺还存在缺少中试放大的问题，有待进一步验证完善，后续还会从菟丝子盐炙前后化学成分含量及药理作用差异方面，进一步验证实验优选炮制工艺的可行性。以期为盐菟丝子炮制工艺的参数具体化提供理论依据，为后续盐菟丝子质量标准建立及炮制机理探讨奠定基础。