基于特征图谱和多指标成分含量测定的复方臭灵丹合剂质量评价

王莉莉，李争艳，陆兔林，张逸婷，张欣蕊，鲍俊浩，谢 辉*，余晓玲*

（1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2.昆明市中医医院 药学部，云南 昆明 650011）

复方臭灵丹合剂是昆明市中医医院生产的医院制剂，处方由主产于我国云南省的臭灵丹草配伍西青果、鱼腥草、滇柴胡、桔梗组成，具有清热疏风、解毒利咽、止咳祛痰的功效[1]，主要治疗病毒性肺炎、咽炎、支气管炎等[2-4]。

复方臭灵丹合剂质量标准收载于《云南省药品监督管理局医疗机构制剂标准》[1]，标准中除制剂通则检查项目外仅收载了方中一味药的薄层鉴别，质量评价手段单一，标准亟待完善。目前，关于复方臭灵丹合剂的质量研究报道较少[5-6]，为了表征该制剂中各种组分的群体特征，本研究采用HPLC 法建立复方臭灵丹合剂的特征图谱，同时测定该制剂中7 个指标成分的含量，为完善该制剂的质量表征方法提供参考，为其后续开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪（全自动进样器，2998 型DAD 检测器，Empower 液相色谱工作站，美国Waters 公司）；PT-124/85S 型分析天平（十万分之一，华志电子科技有限公司）。

1.2 材料

15 批复方臭灵丹合剂由昆明市中医医院提供（编号：S1 ～ S15，批号分别为：21070801、22070501、21112201、21101001、20110901、21082701、21122101、22040501、21100801、21111801、21101001、22010201、22051001、22040301、22031501，规格：250 mL/瓶）。没食子酸对照品（批号：110831-201906，纯度：91.5%）、芦丁对照品（批号：100080-200707，纯度：90.5%）、金丝桃苷对照品（批号：111521-201809，纯度：94.9%）、槲皮素对照品（批号：100081-201610，纯度：99.1%）、洋艾素对照品（批号：111879-201102，纯度：97.2%）、绿原酸对照品（批号：110753-200413）均购于中国食品药品检定研究院。异绿原酸C 对照品（批号：20120302，纯度≥98%）、异鼠李素对照品（批号：J30GB154008，纯度≥98%）、牡荆素对照品（批号：M12GB148216，纯度：98%）购自上海源叶生物科技有限公司；槲皮苷对照品（批号：J2126628，纯度≥98%）、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷对照品（批号：J1825078，纯度≥90%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山柰酚对照品（批号：K2452C186，纯度≥98%）购自上海麦克林生化科技有限公司。乙腈（美国TEDIA公司）、甲醇（美国TEDIA 公司）、磷酸（批号：H2020219，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），以上试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 特征图谱

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Waters Xselect HSS T3柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～ 5 min，4%→8%A；5 ～ 10 min，8%→10%A；10 ～ 20 min，10%→15%A；20 ～ 40 min，15%→19%A；40 ～ 55 min，19%→32%A；55 ～ 65 min，32%→40%A；65 ～80 min，40%→52%A；80 ～ 88 min，52%→55%A；88 ～ 90 min，55%→4%A）；检测波长为0 ～ 10 min，270 nm；10 ～ 90 min，350 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为35℃；进样体积为10μL。

2.1.2 对照品溶液制备 取没食子酸、绿原酸、牡荆素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、异绿原酸C、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、洋艾素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为51.90 μg/mL、61.90 μg/mL、10.40 μg/mL、52.90 μg/mL、28.35 μg/mL、5.95 μg/mL、102.10 μg/mL、74.75 μg/mL、47.90 μg/mL、4.20 μg/mL、2.55 μg/mL、40.80 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取复方臭灵丹合剂25 mL，置50 mL 容量瓶中，加甲醇20 mL，超声30 min，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。用50%甲醇10 mL 洗涤量瓶及滤渣，合并滤液及洗涤液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察 （1）精密度试验 取复方臭灵丹合剂（编号：S8），按“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件连续进样6次，以绿原酸为参照峰（S），计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，其RSD 值分别小于0.31%和2.55%，表明仪器精密度良好。

（2）重复性试验 取复方臭灵丹合剂（编号：S8），按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件进样，以绿原酸为参照峰（S），计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，其RSD 分别小于0.52%和2.95%，表明该方法重复性良好。

（3）稳定性试验 取复方臭灵丹合剂（编号：S8），按“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，以绿原酸为参照峰（S），计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，其RSD 值分别小于0.72%和2.80%，表明样品在24 h 内稳定性良好。

2.1.5 特征图谱的建立 取15 批复方臭灵丹合剂，按照“2.1.3”项下方法制备15 批供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，以S1 号样品色谱图为参照，采用平均数法，时间窗设为0.5，经多点校正峰匹配，得到15 批复方臭灵丹合剂的特征图谱与对照图谱的相似度分别为0.994、0.959、0.990、0.995、0.946、0.998、0.959、0.987、0.996、0.994、0.999、0.989、0.999、0.970、0.998，相似度均大于0.940，表明不同批次复方臭灵丹合剂的化学成分相似性良好。15 批复方臭灵丹合剂特征图谱叠加图谱见图1。通过比较分析15 批样品的特征图谱，共标定了21 个特征峰，通过与对照品色谱峰进行比对，指认了其中12 个特征峰，1 号峰为没食子酸、4 号峰为绿原酸、6 号峰为牡荆素、7 号峰为芦丁、8 号峰为金丝桃苷、9 号峰为槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷，12 号峰为槲皮苷、13 号峰为异绿原酸C，14 号峰为槲皮素，16 号峰为山柰酚，17号峰为异鼠李素、21 号峰为洋艾素，选择分离度较好、峰面积较大的4 号峰作为参照峰，计算特征峰的相对保留时间，结果见表1。混合对照品溶液及复方臭灵丹合剂供试液的特征图谱见图2。复方臭灵丹合剂特征图谱中有21个特征峰，其中12个峰（峰1、4、6、7、8、9、12、13、14、16、17、21） 分别与相应的参照物保留时间相同。以绿原酸参照物峰相应的峰为S 峰，计算其余特征峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内，规定值为0.413（峰2）、0.716（峰3）、1.066（峰5）、2.339（峰10）、2.445（峰11）、3.380（峰15）、4.093（峰18）、4.303（峰19）、4.325（峰20）。

图1 15 批复方臭灵丹合剂HPLC 特征图谱叠加图（S1 ～ S15）Fig.1 Characteristic chromatogram of 15 batches of Compound Choulingdan Mixture (S1 ～ S15)

图2 混合对照品溶液（A）和复方臭灵丹合剂供试液（B）HPLC 图谱Fig.2 HPLC chromatograms of mixed standard solution (A) and Compound Choulingdan Mixture (B)

表1 特征峰相对保留时间Tab.1 Relative retention time of characteristic peaks

2.1.6 共有峰归属 按照复方臭灵丹合剂的制法分别制得臭灵丹草、鱼腥草、滇柴胡、桔梗、西青果单味饮片水煎液，按“2.1.3”项下方法制备各单味药样品供试液，进样测定获得图谱，见图3。以各色谱峰的保留时间、紫外吸收光谱图为鉴别依据，结果表明，10、15、18、21 号色谱峰为臭灵丹草特征峰；16、17、19、20 号色谱峰为滇柴胡特征峰；1 号色谱峰为西青果特征峰；2 号色谱峰为桔梗特征峰；3 号色谱峰为臭灵丹草、西青果、鱼腥草、滇柴胡所共有；4、5 号色谱峰为臭灵丹草、鱼腥草、滇柴胡所共有；6、8 号色谱峰为臭灵丹草、鱼腥草所共有；7、9 号色谱峰为臭灵丹草、滇柴胡、鱼腥草所共有；11、13 号色谱峰为臭灵丹草、滇柴胡所共有；12、14号峰为鱼腥草、滇柴胡所共有。

图3 复方臭灵丹合剂各单味药供试液HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of single herb sample solution of Compound Choulingdan Mixture

2.1.7 聚类分析（CA） 采用IBM SPSS Statistics 26.0 分析软件对21 个特征峰的峰面积数据进行Z-Score 标准化处理后，采用组间连接聚类方法对15个样品进行聚类分析。结果见图4。结果显示当平方欧氏距离为15 时，可将15 批复方臭灵丹合剂聚为2类，样品S4 ～ S6、S2、S9、S11、S15 聚为一类，样品S1、S3、S7、S8、S10、S12 ～ S14 聚为一类。这表明复方臭灵丹合剂样品存在批次间质量差异。

图4 15 批复方臭灵丹合剂的聚类分析树状图Fig.4 Cluster analysis dendrogram of 15 batches of Compound Choulingdan Mixture

2.2 多指标成分含量测定

2.2.1 色谱条件 与“2.1.1”项下色谱条件一致。

2.2.2 供试品溶液制备 与“2.1.3”项下供试品溶液的制备方法一致。

2.2.3 对照品溶液制备 取没食子酸、绿原酸、芦丁、槲皮苷、异绿原酸C、槲皮素、洋艾素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为103.80 μg/mL、123.80 μg/mL、105.80 μg/mL、204.20 μg/mL、149.50 μg/mL、95.80 μg/mL、81.60 μg/mL 的 混 合对照品溶液。

2.2.4 方法学考察 （1） 线性关系考察 吸取“2.2.3”项下混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释成系列浓度的对照品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件分别进样测定，以各对照品进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。结果表明，7 种成分在线性范围内线性关系良好。

表2 复方臭灵丹合剂7 个成分的线性关系考察Tab.2 Linear relationship of 7 ingredients of Compound Choulingdan Mixture

（2）精密度试验 取复方臭灵丹合剂（编号S8），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。没食子酸、绿原酸、芦丁、槲皮苷、异绿原酸C、槲皮素、洋艾素峰面积的RSD 值分别为1.20%、1.13%、1.23%、1.17%、1.90%、0.66%、1.26%，表明仪器精密度良好。

（3）重复性试验 取复方臭灵丹合剂（编号：S8）供试品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行制备6 份样品，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。没食子酸、绿原酸、芦丁、槲皮苷、异绿原酸C、槲皮素、洋艾素峰面积的RSD值分别为2.63%、2.77%、2.90%、2.79%、2.58%、1.85%、1.36%，结果表明该方法重复性良好。

（4）稳定性试验 取复方臭灵丹合剂（编号：S8），按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 时，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。没食子酸、绿原酸、芦丁、槲皮苷、异绿原酸C、槲皮素、洋艾素峰面积的RSD 值分别为2.94%、2.21%、3.07%、1.83%、0.62%、1.90%、3.11%，结果表明样品在24 h 内稳定性良好。

（5）加样回收率试验 精密吸取已知成分含量的复方臭灵丹合剂12.5 mL，共6 份，分别按照样品中成分含量的100%加入各对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录没食子酸、绿原酸、芦丁、槲皮苷、异绿原酸C、槲皮素、洋艾素色谱峰的峰面积，并计算其平均加样回收率分别为97.87%、98.71%、97.69%、101.38%、100.33%、100.13%、99.64%，RSD 分别为0.91%、1.03%、1.94%、1.23%、1.76%、1.46%、1.44%，表明该方法的准确度良好。

2.2.5 多指标成分含量测定 取15 批复方臭灵丹合剂，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算7 个成分的含量，结果见表3。15 批复方臭灵丹合剂中没食子酸、绿原酸、芦丁、槲皮苷、异绿原酸C、槲皮素、洋艾素的含量分 别 为3.91 ～ 15.60 μg/mL、4.72 ～ 12.64 μg/mL、3.72 ～12.56 μg/mL、7.21 ～ 19.14 μg/mL、2.36 ～ 5.77 μg/mL、0.86 ～ 3.18 μg/mL、2.71 ～ 7.32μg/mL。

表3 15 批复方臭灵丹合剂中7 个成分的含量测定结果(μg/mL, n = 2)Tab.3 The results of the determination of 7 ingredients in 15 batches of the compound Choulingdan Mixture (μg/mL, n = 2)

2.2.6 主成分分析（PCA） 采用IBM SPSS Statistics 26.0 分析软件对7 个成分的含量数据进行Z-Score 标准化处理，KOM 检验法和Bartlett 球体检验法的结果显示KOM 值为0.631，Bartlett 球体检验的Sig 值＜0.05，表明数据存在一定的相关性，支持主成分分析。以特征值≥1 作为提取标准，共得到2 个主成分，第1 主成分特征值为4.816，方差贡献率为68.800%，第2 主成分的特征值为1.214，方差贡献率为17.347%，其累计方差贡献率达到了86.147%，能够代表样品的大部分信息。成分矩阵能反映变量与主成分的相关程度，载荷系数的绝对值越大，越接近于1，主成分与该变量相关程度越高，该变量对主成分的贡献度也越大[7]。由表4 可知，主成分1 主要反映了槲皮苷、槲皮素、绿原酸、没食子酸、芦丁、异绿原酸C 成分含量的信息，对主成分2 贡献较大的是洋艾素成分含量的信息，2 个主成分包含化学成分的所有信息，表明复方臭灵丹合剂的质量影响因素是多成分相互作用的。根据载荷矩阵计算主成分得分和以各个主成分方差贡献率占两个主成分总方查贡献率为权重计算的综合得分。结果见表5。根据综合得分可知，S1、S3、S7、S8、S10、S12 ～ S14样品的综合得分为正数，其余批次的样品得分为负数，这与聚类分析和含量测定结果相符。将标准化处理后的数据导入SIMCA-P 14.1 软件，绘制主成分分析得分散点图，结果见图5。从结果可知15 批复方臭灵丹合剂可被分为2 类，对应的批次与特征图谱聚类分析结果一致。

图5 主成分得分散点图Fig.5 Scatterplot of principal component score

表4 初始因子荷载矩阵Tab.4 Component matrix

表5 主成分得分及综合评分Tab.5 Rank of principal component scores and comprehensive scores

2.2.7 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

为了更客观地反映各批次制剂质量的差异性，在主成分分析的基础上，将15 批复方臭灵丹合剂的7个成分含量的数据导入到SIMCA-P14.1 软件中，进行有监督模式的OPLS-DA 分析。得到的模型拟合参数R2Xcum= 0.821，R2Ycum= 0.826，Q2cum= 0.684，表明建立的数学模型稳定且预测能力较好[8]。OPLS-DA 的得分见图6，结果表明样品被分2 类，与PCA 结果一致。为防止模型出现过拟合，对模型进行200 次置换检验验证，置换检验参数的R2、Q2的截距分别为0.109、-0.566，结果见图7。最右端的R2和Q2均大于左端随机排列产生的R2和Q2，表明建立的模型中不存在过拟合现象。变量重要性投影值（VIP）是筛选差异性化合物的重要指标，VIP 的大小与变量差异的影响程度成正比[9]。以VIP ＞1 为判定标准，筛选出5 个贡献度较大的变量，结果见图8，依次为槲皮苷、槲皮素、异绿原酸C、绿原酸、没食子酸，表明这5 个成分是引起制剂质量差异的主要成分。

图6 OPLS-DA 得分图Fig.6 OPLS-DA score plot

图7 OPLS-DA 模型置换检验图Fig.7 OPLS-DA permutation test

图8 VIP 值图Fig.8 VIP value

3 讨论

3.1 色谱条件优化

分别考察了乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液3 种流动相系统，结果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱时，色谱峰响应值较大且峰形较好。考察了Waters Xselect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5μm）、Hanbon Hedera ODS-1（4.6 mm×250 mm，5μm）、Waters XTerra C18（4.6 mm×250 mm，5μm）三种色谱柱，结果发现，不同色谱柱对复方臭灵丹合剂中的槲皮苷、没食子酸色谱峰的分离度影响较大，最终确定选择Waters Xselect HSS T3 色谱柱。采用二极管阵列检测器对复方臭灵丹合剂进行紫外全波长扫描，结果表明，在350 nm 波长下各成分响应较好，色谱峰信息较为丰富，在270 nm 下，没食子酸紫外吸收较强，为了使多指标成分能在同一张色谱图中显现，采用了分段变波长法检测。

3.2 特征图谱分析

特征图谱标定的21 个特征峰中，西青果和桔梗的特征峰信息较少。西青果单味药供试液进样后虽然在270 nm 色谱峰比350 nm 多，但归属于西青果的特征峰很少，兼顾其他药味的整体评价，在10 ～ 90 min选择了350 nm 为检测波长。全波长扫描下发现桔梗单味药在不同波长下的特征峰信息都较少，这与桔梗中的桔梗皂苷D 等皂苷类成分通常无紫外吸收或处于末端吸收响应值低有关，后期可采用诸如红外光谱检测技术[10-11]、蒸发光散射检测技术[12]等进一步完善这两味药的信息表征。

3.3 含量测定指标成分的选择

臭灵丹草味辛、性寒，具有清热解毒、止咳祛痰的功效，为方中君药，含有臭灵丹酸、臭灵丹二醇等桉烷型倍半萜成分，洋艾素、金腰乙素等黄酮类成分以及挥发油、氨基酸等其他成分[13]。洋艾素在2020年版《中国药典》（一部）中作为臭灵丹草含量测定项下的指标成分，具有抑菌抗氧化等药理作用[14-15]。没食子酸、绿原酸、异绿原酸C 等酚酸类成分具有抗菌、抗炎、抗病毒等药理作用[16-19]，芦丁、槲皮苷、槲皮素等黄酮类成分具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抑菌活性[20-21]，这些成分均有抑菌抗炎的药理活性，且在图谱中含量相对较高，是复方臭灵合剂治疗上呼吸道感染的活性成分，因此本研究测定了上述7 个指标性成分的含量。

3.4 含量测定结果分析

PCA 和OPLS-DA 将15 批复方臭灵丹合剂分为两类，与特征图谱聚类分析结果一致。结合含量测定结果发现S4 ～ S6、S2、S9、S11、S15 批次中的槲皮苷、槲皮素、绿原酸等指标性成分含量低于其他批次。通过OPLS-DA 筛选出的5 个化学质量差异标志物归属于处方中的臭灵丹草、鱼腥草、滇柴胡、西青果药味，表明不同批次复方臭灵丹合剂含量差异可能是由饮片质量差异导致。这提示了企业在制剂生产过程中需规范药材产地与采收加工方法、完善饮片质量标准并选用优质饮片投料生产，从而保障复方臭灵丹合剂的质量和临床疗效。

4 结论

本研究建立了15 批复方臭灵丹合剂的HPLC 特征图谱和7 种活性成分含量测定方法，结合化学计量学模型分析筛选出槲皮苷、槲皮素、异绿原酸C、绿原酸、没食子酸等5 个质量差异标志物，为该制剂的深入研究与质量提升提供了依据。桔梗中的主要活性成分为三萜皂苷类，在本研究中紫外检测条件下无法有效表征其特征信息，后续将采用适宜的方法如蒸发光散射检测器等对其质量进一步分析，从而更为全面地对复方臭灵丹合剂进行质量控制。