基于GC-MS 及化学计量学分析蘘荷鲜、干品不同部位挥发油成分

杨明宇，李蒙禹，黄 哲，杨本蓉，孙庆文，杨 烨

（贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025）

蘘荷Zingiber mioga(Thunb.) Rosc.源于姜科姜属植物，别名苴蒪、嘉草、莲花姜，是一种药食兼用的植物资源，其根、茎、花、叶均可供药用，味辛、性温，具有解毒消肿、活血调经、祛痰止咳等功效，主治跌打损伤、月经不调、咳嗽、气喘等症[1]。蘘荷中除含有黄酮、多糖类化学成分还含有多种氨基酸营养物质，现代药理学研究表明其具有抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病等多种药理活性[2-6]。目前，蘘荷国内外研究包含提取工艺优化、抗菌、抗氧化等，且大部分涉及其挥发油成分的药效价值研究，表明挥发性成分是蘘荷发挥药效作用的主要成分之一[7-14]。然而蘘荷的挥发性成分在鲜、干品中和不同部位中的含量差异尚未明确，不利于蘘荷挥发性成分的开发利用，故进一步对蘘荷鲜、干品不同部位中的挥发性成分进行差异分析十分必要。

化学计量学可以优化化学量测过程，并从化学量测数据中最大限度地提取有用的化学信息，结合多元统计分析方法广泛应用于化学分析、生物鉴定、物证考察等方面，基于其多元统计算法（主成分分析、聚类分析、判别分析等），能描述多因素、多变量之间复杂的相互关系，普遍应用于中药的化学分析中[15-16]。

本研究基于气相色谱-质谱（GC-MS）联用分析法，鉴定鲜、干品蘘荷的地上茎叶和地下块茎中的挥发油成分，并利用化学计量方法来统计其鲜、干品不同部位所含挥发性成分的种类、数量及含量差异，探讨其鲜、干品不同部位所含共有成分和特有成分的药效价值，以期为蘘荷挥发性成分的开发利用及其质量评价提供参考。

1 材料

1.1 试药

实验样品采集于贵州省苗族侗族自治州剑河县观么乡，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为姜科姜属植物蘘荷Zingiber mioga（Thunb.）Rosc.全草。

1.2 仪器与试剂

HP6890A/5975C 型 GC-MS 联用仪（美国安捷伦科技公司）；GZX-GF101-2-S-II 型电热恒温鼓风干燥箱（上海贺德实验设备有限公司）；98-I-B 型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；HPD-YAZD-5 型纯水蒸馏器（常州市华普达教学仪器有限公司）。

无水硫酸钠（批号：20100308，重庆茂业化学试剂有限公司）；正己烷（批号：20180108，天津市富宇精细化工有限公司）；实验用水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 干品蘘荷制备

取净制后的蘘荷样品，于电热恒温鼓风干燥箱中35 ℃烘干，粉碎后备用。

2.2 挥发油提取

根据2020 年版《中国药典》（四部）通则2204“挥发油测定法-甲法”提取样品挥发油[16]，精确称取蘘荷鲜品茎叶、鲜品块茎、干品茎叶、干品块茎样品各100 g，置于挥发油提取器中，加水适量，浸泡过夜，加入3.00 mL 正己烷，冷凝回流提取12 h 后，静置1 h，得到有特殊气味黄色的油状体3.00 mL（含正己烷），加适量无水硫酸钠干燥后作为供试品备用。

2.3 GC-MS 检测

2.3.1 GC-MS 色谱条件 气相色谱：色谱柱为HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，初始温度52 ℃（保留2 min），以6 ℃/min 升温至310 ℃（保留7 min），运行时间为52 min；气化室温度为250 ℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压为16.94 psi；载气流量为1.0 mL/min；分流比为10 : 1；溶剂延迟时间为6.0 min。质谱：离子源为EI 源；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；电子能量为70 eV；发射电流为34.6 μA；倍增器电压为1 671 V；接口温度为280 ℃；质量范围为29 ～ 500 amu；进样体积为2 μL。

2.3.2 数据处理 经分析比较，确定筛选后的GC-MS 色谱条件对色谱峰能达到较好的分离。所得色谱和质谱信息经质谱计算机数据系统（NIST2017、Wiley275）检索及核对得到标准质谱图，采用峰面积归一法测定各化学成分在挥发油中的相对含量。

2.4 蘘荷挥发油成分分析

2.4.1 鲜、干品不同部位挥发油成分分析 所得的色谱和质谱信息经质谱计算机数据系统检索及核对Nist 2017 和Wiley 275 标准质谱图，并用峰面积归一法测定各化学成分在挥发油中的相对百分含量，得到总离子流图（图1）、成分及相对含量（表1、表2），通过图1 对比蘘荷茎叶与块茎可知，蘘荷干品中的挥发油成分明显多于鲜品。由表1、表2 可知，从鲜、干品蘘荷中检测出144 个化合物，包含了烃类、醇类、醛类、酮类、酯类、酚类及其他，其中，鲜品蘘荷有58 个，茎叶含32 个，块茎含42 个，两者的相对含量分别占总相对含量92.704%和91.279%，二者共有化合物有16 个；干品蘘荷中有86 个，茎叶含54个，块茎含61 个，两者的相对含量分别占总相对含量91.526%、96.892%，其共有化合物有29 个，在检测中有部分化合物未被确证，其相对含量详见表3。

图1 鲜、干品蘘荷不同部位挥发油总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile oil from different parts of fresh and dried Zingiber mioga

表2 蘘荷干品挥发性成分GC-MS 分析Tab.2 GC-MS analysis of volatile components of dried Zingiber mioga

表3 蘘荷鲜、干品不同部位挥发油成分的相对百分含量及数量Tab.3 Relative percentages and amounts of volatile oil components in different parts of fresh and dried Zingiber mioga

2.4.2 共有成分分析 蘘荷鲜品茎叶、鲜品块茎、干品茎叶与干品块茎四个不同部位之间的共有成分有7 个，分别为α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、α-水芹烯、4-异丙基甲苯、4-萜烯醇、异丙基环己烯酮，其在不同部位中的相对含量总和存在显著差异，分别为13.119%、61.246%、2.817%、55.875%，以7 个共有成分在不同部位中的相对含量为指标，运用SPSS 26.0 软件验证数据，其中，鲜品茎叶P= 0.032，鲜品块茎P= 0.663，干品茎叶P= 0.343，干品块茎P= 0.358，数据满足正态性（P＞0.01）后进行单样本T 检验，结果显示P＜0.01，表明鲜、干品不同部位之间的挥发性成分相对含量确有显著差异。利用Origin 2021 软件作7 个共有成分的百分含量堆积图（图2），图中显示7 个共有成分均在蘘荷块茎中含量最高，其中桧烯、α-水芹烯的相对含量在干品块茎中最高，其余5 个共有成分在鲜品块茎中相对含量较高。

图2 蘘荷鲜、干品不同部位挥发油共有成分堆积图Fig.2 Pileup of volatile oil components in different parts of fresh and dried Zingiber mioga

分析茎叶及块茎中共有成分的含量差异发现，鲜品茎叶与干品茎叶共有成分15 个，其中，二十二烷、六氢法尼基丙酮、β-蒎烯、隐海松二烯4 个成分经干燥后相对含量增多，其余共有成分干燥后相对含量均明显减少；鲜品块茎与干品块茎共有成分28 个，其中的12 个共有成分经干燥后相对含量增加，尤以3-异丙基-6-亚甲基-1-环己烯、桧烯2 个成分含量增加最为显著，其余共有成分的含量经干燥后均减少，见图3。

图3 蘘荷鲜、干品茎叶及块茎挥发油中共有化合物含量比较Fig.3 Comparison of the content of co-occurring compounds in the volatile oil of fresh and dried stems and leaves and tubers of Zingiber mioga

2.4.3 特有成分分析 除蘘荷鲜、干品不同部位挥发油中的共有成分外，鲜品茎叶中含有特有成分6种，占其挥发油成分总量的9.519%，其中，醛类2 种（1.224%），酯类3 种（6.685%），醇类1 种（1.610%），主要特有成分为亚油酸甲酯（4.615%），α-反式-倍半环己醇（1.610%），亚麻酸甲酯（1.485%）；鲜品块茎中含有特有成分3 种，仅占其挥发油成分总量的0.196%，其中，醇类2 种（0.158%），酮类1 种（0.038%），主要特有成分为香叶基-芳樟醇（1.127%）；干品茎叶中含有特有成分12 种，占其挥发油成分总量的6.599%，其中，烃类4 种（2.714%），醇类3 种（2.506%），酮类3 种（0.907%），醛类苯乙醛（0.086%），酚类香芹酚（0.151%），酯类乙酸桃金娘烯酯（0.235%），主要特有成分为棕榈醇（1.338%）、β-榄香烯（1.189%）、α-甜没药烯（1.078%）；干品块茎含有特有成分10 种，占其挥发油成分总量的2.678%，特有烃类2 种（0.406%），醇类6 种（1.615%），醛类2 种（0.113%），以及其他1 种（0.544%），其中鲜品块茎所含特有成分的数量及含量均较低，其所含特有成分含量小于1%。

2.5 化学计量学分析

2.5.1 聚类分析(CA) 基于GC-MS 获得的鲜、干品蘘荷不同部位的挥发性成分含量数据，将其导入微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn），采用欧氏距离法制作聚类热图（颜色由蓝到红代表含量由低到高）见图4，聚类分析结果将鲜品茎叶、干品茎叶、鲜品块茎、干品块茎分为两类，其中，鲜品块茎及干品块茎先聚为Ⅰ类，后与鲜品茎叶聚为Ⅰ类，该类别中含量高的色块较为接近且其所含高含量成分大部分相同，如：α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、4-异丙基甲苯、3-异丙基-6-亚甲基-1-环己烯、γ-松油烯、4-萜烯醇等；干品茎叶单独为Ⅱ类，该类成分中总体含量较高的为烷烃类，如：二十三烷、正二十四烷、二十五烷、二十六烷、二十七烷、二十八烷、二十九烷、三十烷、三十一烷、三十二烷、正三十三烷等，故聚类结果表明鲜、干品蘘荷不同部位的挥发性成分在GC-MS 指纹图谱上存在差异。

2.5.2 主成分分析(PCA) 利用多元统计软件SIMCA 14.1 对鲜、干品蘘荷不同部位的挥发油含量进行PCA 计算，筛选出蘘荷不同部位之间方差贡献最大的两个主成分为PC1（累积方差贡献率为49.49%）、PC2（累积方差贡献率为29.80%），两主成分方差贡献率之和为79.29%，表明两主成分能很好的解释蘘荷药材所含的挥发油成分特征，做PCA评分图及不同部位中PC1、PC2 分值图（见图5），图中结果显示鲜品块茎及干品块茎先聚为Ⅰ类，以贡献率较大的PC1 分值区分，鲜品茎叶与鲜品块茎及干品块茎得分更近，三者聚为Ⅰ类，而干品茎叶在PC1 的得分中与其余三者差异较大，故单独聚为Ⅱ类，该结果与聚类热图分析结果一致。

图5 PCA 评分图及不同部位中PC1、PC2 分值图Fig.5 PCA score diagram and PC1, PC2 score diagram in different parts

2.5.3 偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 在SIMCA 14.1 软件中计算蘘荷挥发油成分在鲜品茎叶、鲜品块茎、干品茎叶、干品块茎所含成分含量的变量重要性投影值（VIP 值）（见图6），VIP 值的大小表示该成分对不同部位的贡献程度，一般而言，VIP＞1，说明其对模型有显著贡献[17]，鲜品茎叶中VIP＞1 的成分有17 个，其中已知成分有12 个（见图6A）；干品茎叶中VIP＞1 的成分有38 个，其中已知成分有37 个（见图6B）；鲜品块茎中VIP＞1 的成分有14 个，已知成分14 个（见图6C）；干品块茎中VIP＞1 的成分有22 个，已知成分21 个（见图6D）。

图6 不同部位偏最小二乘判别分析的VIP 值Fig.6 VIP values of partial least squares discriminant analysis in different parts

从鲜、干品蘘荷挥发油成分的VIP 值来看，干品所含的挥发油成分贡献值较高；从蘘荷不同部位挥发油成分的VIP 值来看，其茎叶所含成分的贡献度值大于块茎，总体VIP 值排序为干品茎叶＞干品块茎＞鲜品茎叶＞鲜品块茎。

3 讨论

《中华本草》及《中药大辞典》[1,18]上记载蘘荷鲜用可治舌口疮烂、杂物眯目不出，干用主治失声喉痹，表明蘘荷鲜、干品具有一定的药效差异，同时蘘荷不同部位之间的药效作用也存在较大差异，如蘘荷叶具有温疟寒热功效；蘘荷花主治肺寒咳嗽；蘘荷根茎主治疗跌打损伤等[19-22]，而本研究结果显示蘘荷鲜、干品不同部位提取挥发油成分的含量确有显著差异，挥发油成分又是蘘荷的主要药效成分之一，故这可能是蘘荷鲜、干用及其不同部位之间存在药效差异的原因。

此外，在不同部位挥发油共有成分分析中发现，4-萜烯醇、β-蒎烯具有较强的生物活性及药效价值[23-24]；对各部位特有成分进行分析发现，鲜品茎叶中含有的特有成分亚油酸甲酯（4.615%）具有一定的抗炎作用及杀螨活性[25-26]；鲜品块茎中特有成分香叶基-芳樟醇（1.127%）常被林业用做防治害虫[27]；干品茎叶中特有成分棕榈醇（1.338%）能作为热能储存的相变材料[28]，β-榄香烯（1.189%）则具有多种抗癌作用[29]，表明蘘荷不同部位均有一定的药效价值，其中，干品茎叶中所含特有成分数量排在首位（12 个），且大部分成分都具有较高的药效活性[30]。

聚类热图按照蘘荷各部位挥发油成分含量之间的相似性进行分组归类，显示干品茎叶的色块较深，与其他三者相似性较差，单独聚为一类；主成分分析时干品茎叶的方差得分区别与其他三者，单独聚为一类；二者分析结果一致，但CA 和PCA 只是将多变量的蘘荷挥发油含量数据进行相似度分类、降维处理来解释多变量之间的关系。为进一步探索蘘荷鲜、干品不同部位之间的含量差异，本文应用偏最小二乘判别分析，利用各部位的成分含量的VIP 值进行筛选及排名，排名结果显示干品茎叶中所含VIP ＞1，贡献度高的成分较多，区别于其余三者，这与CA 及PCA 分析结果一致，三种方法所得结果互相印证。但所得判别分析结果与GC-MS 计算相对含量大小结果不一致，原因可能是GC-MS 鉴定所得的含量仅代表了不同部位中成分含量的高低，与其在蘘荷挥发油中的贡献度大小没有直接关联，而判别分析的VIP值则能明确反映该成分含量对该部位的贡献值。结合三种化学计量学方法及特有成分分析结果，初步表明本研究中蘘荷干品茎叶的药效价值可能更高。

4 结论

本研究结果可为蘘荷挥发油成分的物质基础研究提供参考，并为后期深入开发利用蘘荷挥发性资源提供理论依据。同时因GC-MS 图谱中还存在部分尚未明确的成分，部分未明确成分的含量在鲜、干品不同部位的挥发油成分中占比较高，在PLS-DA 分析中的VIP 值也不低，故后续可结合更多高分辨分析方法进行鉴定。此外，本研究对蘘荷的干燥方式仅为低温干燥，后续可考虑结合更多蘘荷干燥方式对其干品所含挥发油成分的变化进行考察。