斜叶檀醇提物不同极性部位对皮肤伤口愈合的影响

2023-10-09宋卓悦张丹雁唐纯志李世杰

现代中药研究与实践 2023年4期

于恬，宋卓悦，张丹雁，李攀，唐纯志，刘涛，李世杰*

（1.广州中医药大学针灸康复临床医学院华南针灸研究中心，广东广州 510006；2.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006）

斜叶檀为豆科蝶形花亚科植物斜叶黄檀Dalbergia pinnata（Lour.）Prain 富含树脂的木质藤茎[1-2]。《中华本草》记载其“性温味辛，具祛风止痛、活血敛疮的功效，可用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、月经不调及下肢溃疡”[2]，古战场亦将其用作止血药[3]。课题组前期调研发现，我国海南、云南等地居民常将其泡酒用于治疗跌打损伤，或粉碎后敷于患处用于治疗烧烫伤、创伤、下肢溃烂等。近年来，关于斜叶檀的研究报道，多集中在品种鉴定[4]、质量标准[5]和对其挥发油的成分分析及药理活性研究[6]上，对其能够促进伤口修复的功效研究较少。为充分发掘民间药用资源，扩大斜叶檀的应用范围，本研究基于典籍记载及民间应用，拟制备不同极性部位的斜叶檀提取物，考察其对烧烫伤及创伤模型创面修复的活性，并筛选出最佳的药效部位，为开发斜叶檀外用药提供理论基础。

1 材料

1.1 实验动物

普通级雄性新西兰兔54 只，体质量为1.8 ～2.2 kg，85 ～ 95 日龄，购自广东省医学实验动物中心（三水基地），批号：44411600008274，实验动物许可证号：SCXK（粤）2019-0035。动物饲养于广州中医药大学实验动物中心，自由进食饮水，光照条件保持昼夜交替，适应性饲养7 d。动物实验经广州中医药大学医学伦理委员会批准（批号：20210507004）。

1.2 药物

磺胺嘧啶银软膏（批号：200401，广东恒健制药有限公司）；斜叶檀样品由广州中医药大学中药鉴定教研室张丹雁教授提供，并鉴定其为豆科黄檀属植物斜叶檀Dalbergia pinnata的含树脂木质藤茎。

1.3 试剂

免疫组化试剂盒（批号：BA05265207，北京博奥森生物技术有限公司）；anti-TGF-β1（批号：AF1027，Affinity 生物科技有限公司）；芦丁标准品（批号：C10109003，上海麦克林生化科技有限公司）；美迪紫檀素（批号：RFS-M05302111022，成都瑞芬思生物科技有限公司）；苏木素-伊红（H&E）染色试剂盒（批号：1121A18）、改良Masson 三色染色试剂盒（批号：0819A21）购自北京雷根生物技术有限公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等购自天津市致远化学试剂有限公司，均为分析纯；甘草素（批号：wkq20040906）、异甘草素（批号：wkq20051507）、芒柄花素（批号：wkq20062208）购自四川省维克奇生物科技有限公司；高丽槐素（批号：Y16F10H80999）、紫铆素（批号：Y30M10H84623）购自上海源叶生物科技有限公司。

1.4 仪器

JB-L5 型石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；Donatello 型系统全自动组织脱水机（意大利DIAPATH 公司）；RM2016 型石蜡切片机（德国Leica公司）；CX33 型生物显微镜（日本OLYMPUS 公司）；N-1300 型旋转蒸发仪（EYELA 东京理化器械株式会社）；U-3900 型紫外-可见分光光度计（日本HITACHI 公司）。

2 方法

2.1 斜叶檀醇提物的制备

斜叶檀样品粉碎，过2 号筛，精确称取1.0 g 斜叶檀粉末，按照前期优化的提取工艺条件：乙醇浓度为80%，提取温度为30℃，提取时间为20 min，液料比为15 : 1（mL/g），提取3 次，过滤，浓缩，干燥，即为斜叶檀醇提物浸膏。

2.2 斜叶檀不同极性部位的制备

取适量斜叶檀醇提物浸膏分散于水中，转移至分液漏斗，依次加入等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，振荡2 min 后静置，待分层完全后收集各部位萃取液，萃取至各部位萃取液无色，合并萃取液，浓缩，挥干，得到斜叶檀石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分和水溶液组分，并计算得率。

2.3 总黄酮含量测定

采用AlCl3显色-分光光度法测定总黄酮含量[7]。配制0、5、10、15、20、25、30、35 μg/mL 的芦丁标准品溶液，于414 nm 处测定吸光度值，以芦丁标准品溶液浓度（X,μg/ml）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标绘制标准曲线。取斜叶檀醇提物以及各部位萃取产物，制备样品溶液，测定吸光度，计算样品中总黄酮含量，公式如下：

式中，K为稀释倍数；C为总黄酮浓度（mg/mL）；V为体积（mL）；M0为供试品质量（g）。

2.4 兔烧烫伤及创伤模型的构建

烧烫伤模型：新西兰兔后背脱毛，生理盐水擦拭。选用戊巴比妥钠以30 mg/kg 进行耳缘静脉注射，再用0.1%苯扎溴铵溶液消毒，将50 g 砝码放入水中煮沸10 min，镊子夹起烫兔皮肤10 s。创伤模型：脱毛及麻醉方法参照烧烫伤模型，兔背部设计6 个直径为2 cm 的圆形创面，用手术剪沿标记线剪除皮肤全层至筋膜层，即为全层皮肤急性缺损创面。

2.5 分组及给药

将各萃取部位、斜叶檀粉末、纤维残渣分别与凡士林混合，制成软膏。斜叶檀粉末软膏中含药量为500 mg/g，各萃取部位根据得率换算相应给药软膏的含药量，其中，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位及纤维残渣的凡士林软膏含药量分别为155.05 mg/g、167.15 mg/g、2.35 mg/g、1.50 mg/g、173.40 mg/g。烧烫伤及创伤模型均分为9 组，分别为模型组（MG）、阳性药（磺胺嘧啶银软膏）组（PDG）、斜叶檀粉末组（DPPG）、凡士林组（VG）、石油醚部位组（PEG）、乙酸乙酯部位组（EAG）、正丁醇部位组（BAG）、水部位组（WG）、纤维残渣组（FRG）。模型组伤口给予生理盐水清洗，其他组分别每日在伤口处均匀涂抹0.3 g 的药物，每日给药一次，给至伤口结痂。

2.6 皮肤创面愈合作用的观察

根据伤口恢复情况，烧烫伤实验分别于第0、3、7、14、21 天拍摄并观察创面愈合情况；创伤实验分别于第0、7、9、11、13、16 天拍摄并观察。用硫酸纸描绘各组创面形状，将烧烫伤、创伤创面图扫描，采用Image J 软件计算伤口收缩率，公式如下：

2.7 H&E 及Masson 染色

在烧烫伤后第7、21 天及创伤后第7、16 天时取下皮肤组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h。随后，进行脱水、透明、包埋，切成4 μm 厚度的石蜡切片。常规H&E 染色[8]和Masson 染色[9]处理，显微镜观察并拍片。

2.8 免疫组化染色

参照Magaki 等[10]方法进行免疫组化染色，显微镜观察并拍照，应用Image-Pro Plus 软件计算平均光密度值（积分光密度值与面积的比值）。

2.9 统计学方法

用SPSS 26 软件进行数据分析，采用Shapiro-Wilk 进行正态分布检验，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素分析（One-way ANOVA），方差齐则采用LSD 检验，方差不齐则采用Dunnett' s T3 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同部位提取率及总黄酮含量

斜叶檀醇提物及各萃取部位提取率及其总黄酮含量见表1，不同提取部位中，乙酸乙酯部位提取率及总黄酮含量最高，分别为（33.43 ±0.22）%、（7.03 ± 0.16）%。在未知活性优劣及成分分析的前提下，采用得率及总黄酮含量对各部位进行质量控制。

表1 斜叶檀醇提物及各萃取部位提取率及其总黄酮含量（% , ±s, n = 3）Tab.1 Extraction rate and total flavonoids content of alcohol extract and its extract parts of Dalbergia pinnata (% , ±s, n = 3)

注：同列字母不同，表示P ＜0 05。

样品名提取率总黄酮含量醇提物 65.32 ± 0.72 a 2.45 ± 0.04 d石油醚部位 31.01 ± 0.31 c 0.24 ± 0.01 e乙酸乙酯部位 33.43 ± 0.22 b 7.03 ± 0.16 a正丁醇部位 0.47 ± 0.02 d 4.21 ± 0.14 b水部位 0.30 ± 0.01 d 3.33 ± 0.08 c F 6 232.265 2 679.742 P 0.000 0.000

3.2 烧烫伤实验结果

3.2.1 烧烫伤创面愈合情况烧烫伤创面图见图1，伤口收缩率见表2。与模型组相比，在第3 天时，斜叶檀粉末与乙酸乙酯部位组伤口收缩率明显升高；第7 ～ 21 天，模型组明显化脓，各组（除凡士林组）的伤口收缩率均高于模型组，其中，斜叶檀粉末组的效果最佳、恢复最快，石油醚部位和乙酸乙酯部位组均恢复较快。结果表明，斜叶檀能够促进深Ⅱ度烧烫伤皮肤的愈合，其中，斜叶檀粉末、石油醚部位和乙酸乙酯部位组的恢复效果最佳。

图1 烧烫伤创面图Fig.1 Observation of scalded wound

表2 各组对伤口收缩率的影响（% , ±s, n = 6）Tab.2 Wound shrinkage rate of different group (% , ±s, n = 6)

注：与MG 比较，*P ＜0.05。

分组 3 d 7 d 14 d 21 d MG -20.52 ± 10.51 4.81 ± 4.78 20.01 ± 6.82 92.71 ± 3.22 VG -12.24 ± 12.97 0.92 ± 11.11 9.52 ± 14.51 96.62 ± 2.41 PDG -4.51 ± 9.23* 6.41 ± 10.63 24.47 ± 9.91 96.82 ± 2.93 DPPG -4.09 ± 9.21* 25.84 ± 8.82* 45.61 ± 5.32* 100.00 ± 0.00*PEG -18.41 ± 6.82 20.02 ± 11.88* 23.31 ± 11.74 98.31 ± 1.14*EAG -5.23 ± 8.21* 9.52 ± 8.71 34.83 ± 6.11* 98.63 ± 1.81*BAG -7.62 ± 6.22* 7.81 ± 9.11 25.12 ± 6.13 98.12 ± 0.93*WG -5.71 ± 7.19* 14.12 ± 9.13 29.42 ± 8.52 97.81 ± 2.21*FRG -12.53 ± 7.44 20.21 ± 5.43* 31.91 ± 11.63 95.62 ± 3.34 F 2.919 5.026 6.780 5.655 P 0.010 0.000 0.000 0.000

3.2.2 H&E 染色结果第7 天各组均可见不同程度的皮肤破损，其中，模型组表皮剥落最严重，没有明显的毛囊、汗腺等功能性皮肤附属器的形成，可见大量的炎症细胞浸润；凡士林组和纤维组皮下出血严重；各给药组炎症细胞浸润减少，其中，斜叶檀粉末和石油醚部位的创面恢复效果较好，可见少量新生血管。第21 天模型组依旧有很多炎症细胞浸润，少有毛囊等附属器的形成；与模型组相比，各给药组的皮肤结构几乎完整，但凡士林和纤维组真皮胶原纤维束稀疏、排列紊乱；斜叶檀粉末、石油醚部位、乙酸乙酯部位组表皮层与真皮层连接处紧密无缝，真皮胶原纤维排列整齐，观察到有较多血管、毛囊等附属器的形成。见图2。

图2 第7、21 天烧烫伤组织病理学观察（×100）Fig.2 Histological appearance of burn wounds on day 7 and 21 (×100)

3.2.3 Masson 染色胶原纤维情况如图3 所示，第7 天模型组、凡士林组、阳性药组、水部位组创面有稀疏散在的胶原纤维，且排列紊乱，斜叶檀粉末组、石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组和纤维组胶原形成较多，胶原纤维较粗壮。第21 天模型组胶原纤维较为稀疏，斜叶檀粉末组、石油醚部位组、乙酸乙酯部位组和正丁醇部位组胶原纤维丰富、形态规则、无纤维化、排列整齐致密。

图3 第7、21 天烧烫伤创面胶原纤维情况（×100）Fig.3 Collagen fibers of scalded wounds on day 7 and 21 (×100)

3.2.4 TGF-β1 的表达 TGF-β1 在伤口愈合过程中起着重要作用，随着皮肤损伤的发生，其表达会增加[11]。第7 天，与模型组相比，凡士林组、阳性药组、斜叶檀粉末组、石油醚部位组、乙酸乙酯部位组和正丁醇部位组的TGF-β1 的表达升高，TGF-β1 水平的升高会促进成纤维细胞的增殖与分化，加速再上皮化。第21 天，各组表达差异无统计学意义（P ＞0.05），说明斜叶檀能够促进创面早期TGF-β1 的表达。见图4、图5。

图4 烧烫伤皮肤TGF-β1 免疫组化染色图（×400）Fig.4 Immunohistochemical staining of TGF-β1 in burn skin (×400)

图5 第7（A）、21（B）天TGF-β1 的平均光密度值（n = 6）Fig.5 Average optical density of TGF-β1 on day 7(A) and 21 (B) (n = 6)

3.3 兔创伤实验结果

3.3.1 皮肤创面愈合情况与模型组相比，第7天，阳性药与正丁醇部位组伤口收缩率升高；第9 天，斜叶檀粉末、乙酸乙酯部位和正丁醇部位组伤口收缩率升高；第11 至16 天，与模型组比较，各给药组均恢复较快，但差异无统计学意义（P ＞0.05），斜叶檀粉末、乙酸乙酯部位和正丁醇部位组的创面完全恢复。结果表明，斜叶檀能够促进兔创伤创面的愈合，其中乙酸乙酯部位和正丁醇部位组的效果最佳，其创伤愈合效果及时间优于烧烫伤。见图6、表3。

图6 创伤创面的愈合情况（5 mm）Fig.6 Observation of wound healing (5 mm)

表3 各组对伤口收缩率的影响（% , ±s, n = 6）Tab.3 Wound shrinkage rate of groups(% , ±s, n = 6)

注：与MG 比较，*P ＜0.05。

分组 7 d 9 d 11 d 13 d 16 d MG 16.18 ± 10.21 52.12 ± 11.81 82.01 ± 11.04 94.62 ± 3.83 98.22 ± 1.87 VG 22.32 ± 8.61 62.72 ± 7.94 86.02 ± 6.33 96.71 ± 2.22 99.63 ± 0.51 PDG 29.33 ± 6.32* 54.51 ± 11.32 84.51 ± 1.82 96.02 ± 3.13 99.81 ± 0.41 DPPG 24.81 ± 11.34 67.42 ± 7.41* 85.43 ± 6.14 97.38 ± 1.61* 99.92 ± 0.22 PEG 23.72 ± 10.92 62.73 ± 9.82 89.74 ± 7.22 96.72 ± 2.63 99.51 ± 1.14 EAG 23.13 ± 3.42 72.31 ± 6.82* 86.51 ± 2.14 98.41 ± 1.42* 100.00 ± 0.00 BAG 35.13 ± 7.81* 67.01 ± 8.62* 88.83 ± 3.09 98.83 ± 0.92* 100.00 ± 0.00 WG 25.14 ± 5.61 52.02 ± 6.83 87.62 ± 8.07 98.81 ± 0.81* 99.42 ± 1.02 FRG 28.82 ± 9.43 58.77 ± 10.79 85.71 ± 3.92 97.77 ± 1.32* 99.24 ± 1.31 F 2.166 3.530 0.823 2.389 2.062 P 0.049 0.003 0.586 0.031 0.060

3.3.2 H&E 染色第7 天，模型组和凡士林组相较于其他给药组出血较严重，可见较多红细胞外渗，有较多的炎症细胞浸润。相较于模型组，其他给药组炎症细胞浸润减少，出血程度较轻。斜叶檀粉末组、乙酸乙酯部位组和正丁醇部位组的皮肤恢复效果较好，可见较多新生血管。第16 天，与模型组相比，各给药组的皮肤上皮化几乎完全，正丁醇部位组可见新生毛囊，斜叶檀粉末组、乙酸乙酯部位组和正丁醇部位组真皮胶原纤维排列整齐，可见丰富新生血管。见图7。

3.3.3 Masson 染色第7 天，各给药组胶原形成均比模型和凡士林组多，斜叶檀粉末组与正丁醇部位组胶原形成最多。第16 天模型组胶原形成稀疏紊乱，斜叶檀粉末组、乙酸乙酯部位组和正丁醇部位组胶原形成丰富且排列紧密、规则有序。见图8。

图8 第7、16 天创伤创面胶原纤维情况（×100）Fig.8 Collagen fibers of wounds on day 7 and 16 (×100)

3.3.4 TGF-β1 的表达第7 天，与模型组相比，除凡士林和水部位组，各给药组TGF-β1 的表达均增加。在第16 天各组TGF-β1 的表达均有所下降，与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，斜叶檀能够增加早期创伤组织内TGF-β1的表达。见图9、10。

图9 创伤皮肤TGF-β1 免疫组化染色图（×400）Fig.9 Immunohistochemical staining of TGF-β1 in traumatized skin(×400)

图10 第7（A）、16（B）天TGF-β1 的平均光密度值（n = 6）Fig.10 Average optical density of TGF-β1 on day 7 (A) and 16 (B) (n = 6)

4 讨论

皮肤易受到外部物理、化学和生物等危险因素的损伤，烧烫伤、外伤性损伤在临床中是最为常见的皮肤损伤类型，严重的皮肤大面积缺损会危及生命，同时皮肤损伤还会引起炎症、疼痛以及其他并发症。目前治疗皮肤损伤的药物主要分为中药类和西药类，西药类常用的局部抗菌药物（磺胺嘧啶银、硝酸银等）及各类抗生素等，其长期使用易产生耐药性及二重感染等。中药在治疗烧烫伤[12]以及创伤[13]方面历史悠久，效果显著，且能防止感染。

斜叶檀是一种民间常用药，治疗外伤时，常将其粉末用酒浸泡或将粉末制作成简单剂型涂抹在伤处，用法比较简单，如果将其开发成市售制剂，筛选提取溶剂及有效部位尤为关键。结合该民间用法，本课题选择乙醇作为提取溶剂，按照前期优化过的提取工艺制备斜叶檀醇提物。为了进一步筛选出斜叶檀的活性最佳部位，本研究制备了4 个不同部位的提取物。结果表明，斜叶檀治疗皮肤烫、创伤的效果显著。粉末、乙酸乙酯、石油醚部位均能明显促进烧烫伤伤口愈合，促进深Ⅱ度烧烫伤兔皮肤表皮损伤的修复，减轻炎性细胞浸润，促进胶原沉积以及紧密规则排列，对烧烫伤皮肤具有明显的修复作用。同时，粉末、乙酸乙酯和正丁醇部位均能促进创伤伤口愈合，加速再上皮化进程，减少炎性细胞浸润，促进肉芽组织和新生血管的形成，使胶原形成丰富且排列紧密、规则有序。依据上述结果，粉末对烧烫伤及创伤效果最佳，其次是乙酸乙酯部位。因本研究拟筛选斜叶檀针对烫、创伤的最佳提取部位，结合各部位的提取率结果，选择乙酸乙酯部位为活性最佳部位。课题组前期研究显示，斜叶檀主含挥发油、黄酮类、鞣质类等成分，其中斜叶檀挥发油具有抗菌、消肿散瘀[4]的活性，其醇提物能够缩短皮肤创面愈合时间[14]。挥发油易溶于石油醚，斜叶檀石油醚部位对烧烫伤的作用效果可能与其抗菌、抗氧化作用有关。

药物治疗创面一般通过抑制炎症反应、促进生长因子的分泌与释放、调控胶原的合成与代谢、促进血管生成、促进细胞增殖等几个作用途径。在伤口愈合过程中，TGF-β1 在炎症、血管生成、再上皮化和结缔组织再生中起重要作用[15]。在创面修复早期，TGF-β1 不仅可以促进创面成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖、分化和迁移，还可以直接刺激成纤维细胞分泌细胞外基质，合成胶原蛋白，从而促进创面愈合[11]。本研究测定了创面组织中TGF-β1 的水平，结果发现斜叶檀粉末和乙酸乙酯部位可能是通过调控TGF-β1 依赖的信号通路，促进胶原蛋白的沉积，从而促进皮肤伤口愈合。另外，H&E 染色结果发现，斜叶檀粉末也能够促进创面组织新生血管的生成，新生血管可以为受伤部位提供营养，加速伤口修复。血管内皮生长因子（VEGF）是形成新血管的重要细胞因子，它能促进血管内皮细胞的增殖，产生新血管，因此斜叶檀可能也会通过调控VEGF 介导的相关信号通路来促进创面的修复。