外周血CD4+T、CD8+T细胞PD-1表达对NSCLC诊疗及评估的新进展

张龙志 山长婷 程曼曼 吕高超 徐静 王娴玮

一、肺癌现状

肺癌作为全球癌症死亡的主要原因,在世界范围内死亡率第一、发病率第二[1-3]。在中国,肺癌不仅发病率第一,而且死亡率也位居恶性肿瘤之首[4-5]。2020年癌症数据显示[4],中国新发肺癌约82万例,死亡72万例,面对吸烟、二手烟暴露、空气污染、人口老龄化加剧等因素,中国肺癌发病率和死亡率仍呈现上升趋势[5-6]。

肺癌根据病理学特征分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC约占80%～85%[7-10];肺癌患者发病后不仅进展快,而且转移迅速,多数患者就诊时已发展为中晚期局部侵犯或远端转移,即使治疗其预后也不容乐观。在中国,NSCLC患者Ⅱ期5年生存率约为55%、Ⅲ期20%左右、Ⅳ期不到5%[9-10]。随着肿瘤进展机制被人们深入研究,肿瘤免疫治疗已进入高峰阶段。免疫检查点抑制剂(ICIs)中的PD-1抑制剂已经改变了癌症治疗,成为包括NSCLC在内的多种癌症的治疗标准。与细胞毒化疗相比,ICIs显示出更好的临床疗效和更少的毒性。虽然一些接受ICIs治疗的NSCLC患者已经取得了持久的临床反应,但是受益的患者不超过40%[1,8,11-12],只有少数患者表现出长期持久的反应,其疗效并不像黑色素瘤[13]那么好,这可能与肺部肿瘤在组织学、分子生物学和呼吸道免疫等方面的异质性有关。而且目前还没有明确的生物标志物可以预测ICIs的疗效,因此急需一种反映免疫抑制剂预测性和预后性的生物标志物来指导临床治疗与决策。

二、PD-1结构及功能概述

程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)是免疫细胞上表达的一种免疫抑制蛋白分子,其由胞外免疫球蛋白可变区样结构域、跨膜区以及胞内区组成,其中胞内区包括C端和N端氨基酸残基,含有2个独立的磷酸化作用位点,分别为免疫受体酪氨酸抑制基序和免疫受体酪氨酸转换基序[14-15]。在免疫应答进程中,通过酪氨酸的磷酸化作用,发挥对原受体刺激信号的拮抗效应,在负性调控进程中发挥关键性功能。

PD-1广泛表达于T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和髓系细胞[14-15],但不表达静止T细胞[14,16];其有两个配体,程序性死亡蛋白配体1(programmed death ligand 1,PD-L1)和PD-L2。PD-L1作为B7家族中负性T细胞刺激分子[17],主要表达于造血细胞(包括T细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞等),以及一些非造血细胞(包括血管内皮细胞、胰岛细胞、胎盘合体滋养层细胞和角质形成细胞)[14-15]和肿瘤细胞[14,18]表面;而PD-L2主要表达于树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞等[14,18]。PD-1与其配体结合后,PD-L1/PD-L2可激活 PD-1并诱导T细胞活性下调、细胞因子产生减少、T细胞发生裂解并诱导抗原耐受[15,19],从而削弱免疫反应。PD-1作用于T淋巴细胞诱导其无反应性,相反将PD-1/PD-L1阻断干预后,T淋巴细胞可重新活化;同时PD-1可诱导T淋巴细胞功能耗竭,抑制T细胞的肿瘤杀伤活性;因此PD-1具有在免疫细胞中诱导和维持外周免疫耐受[20-21]、保护组织免受免疫攻击、抑制感染和肿瘤免疫以应对感染或肿瘤进展[14-16,21]的功能。

三、CD4+T、CD8+T细胞概述

免疫是指机体对于外部病原体的入侵所产生的反应,其在病毒感染、肿瘤免疫应答等方面起重要作用,尤其细胞免疫。细胞免疫指T细胞介导的免疫应答,即T细胞受到抗原刺激后,分化、增殖、转化为致敏T细胞,当相同抗原再次进入机体,致敏T细胞对抗原有直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子有协同杀伤作用[22-23]。T细胞作为细胞免疫的主要细胞,在免疫应答过程中发挥中枢性作用。人类外周血T细胞最主要的为辅助性T细胞(Th细胞)和细胞毒性T细胞(CTL),按其细胞表面CD分子表型的不同,分为CD3+CD4+CD8-的CD4+T细胞和CD3+CD4-CD8+的CD8+T细胞,其中Th细胞的主要表面标志是CD4,CTL的主要表面标志是CD8[23-26]。

1 CD4+T细胞

CD4+T细胞作为人体免疫系统中重要的免疫细胞,识别由13～17个氨基酸残基组成的外源性抗原肽,与MHCⅡ类分子的非多肽区结合,活化后可分化为Th细胞和调节性T细胞(Treg细胞)[27-28]。不同的CD4+T细胞分泌不同类型的细胞因子参与细胞免疫和体液免疫应答,从而介导炎症反应和超敏反应。

CD4+T细胞主要为Th细胞,通过分泌多种淋巴因子,其具有协助体液免疫和细胞免疫的功能。CD4+T细胞激发的特异性细胞免疫应答,可引起以淋巴细胞和单核吞噬细胞浸润为主的渗出性慢性炎症[23,29]。此外,CD4+T细胞抑制分子的上调以及活化分子的下调,有利于维护细胞和体液免疫反应平衡;Treg细胞具有免疫抑制功能,CD4+Treg细胞诱导抑制作用的发生[30]。CD4+CD25+Treg细胞参与体内免疫反应,具有免疫调节功能[22,31-32]。同时,Imai N等[28]人发现,CD4+T细胞的存在是产生多功能肿瘤特异性CD8+T细胞的必要条件,它在体内的持久性使肿瘤消退得到加强。

2 CD8+T细胞

CD8分子是一种白细胞分化抗原,为部分T细胞表面所具有的一种糖蛋白,用以辅助T细胞抗原受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导,又称为TCR的共受体[33-35]。表达CD8分子的T细胞即CD8+T细胞,通常在活化后分化为细胞毒性T细胞(CTL)和抑制性T细胞(Ts),后者具有抑制体液免疫与细胞的功能[34],而前者在特异性免疫应答的效应阶段,能通过释放穿孔素、颗粒酶杀伤靶细胞或通过Fas/FasL通路介导靶细胞的凋亡[36],表达PD-1的CD8+T细胞在急性感染过程中也会产生细胞毒性分子[37]。所以,CD8+T细胞是人体免疫系统中一种重要的效应细胞。

CD8+T细胞能够特异性地杀伤靶细胞[33],故CD8+T细胞主要为CTL,表现为细胞毒性。此外,其还具有B细胞的辅助活性和自我反应的抑制(即T细胞调节)[38]两种功能特性。而且,外周血CD8+T细胞比CD4+T细胞更具有自我反应性[31]。

四、PD-1对免疫细胞的负性调控

PD-1作为抑制性受体通过与相应配体作用抑制T细胞进一步激活,从而防止免疫反应无限扩大,维持其处于动态的平衡。PD-1/PD-L1通路不仅是健康人体免疫调节作用中重要的一环,而且影响T细胞的分化[14,39]。在癌症和(或)感染的病理条件下,PD-1/PD-L1的异常表达可导致免疫细胞功能障碍,抑制T细胞反应,并可通过免疫抑制作用促进肿瘤或感染进展[20,30,40]。T细胞(特别是CD4+T细胞、CD8+T细胞)上的PD-1和肿瘤细胞或抗原呈递细胞(APC)上的PD-L1之间的相互作用,使T细胞的激活和T细胞介导的肿瘤细胞杀伤力变弱,其通过参与程序性细胞凋亡过程,对活化的T淋巴细胞进行负性调控,这一过程被认为是引起免疫抑制的重要原因[39,41]。

五、外周血CD4+T、CD8+T细胞PD-1表达水平与NSCLC

肿瘤的发生发展过程与免疫系统的相互关系分为三个阶段:清除、平衡和逃逸。具有逃逸能力的肿瘤细胞可通过其表面的PD-L1和淋巴细胞表面的PD-1结合,从而逃脱免疫系统识别。

研究发现[15,42],与CTLA-4在免疫反应早期和主要在淋巴结中抑制T细胞激活不同,PD-1主要在外周组织中抑制免疫反应后期的T细胞,使PD-1途径阻断对抗肿瘤T细胞具有更特异的效果,同时与CTLA-4阻断相比毒性更小。当人体患肿瘤时,肿瘤细胞上的PD-L1处于高表达状态,PD-L1的高表达可削弱T细胞的杀伤活性,显著增强肿瘤的致瘤性和侵袭性,PD-L1与CD8+T细胞上的PD-1相结合,传递出抑制性调节信息,抑制CD8+T细胞的细胞活性,使相应的细胞凋亡或引起免疫调节功能失效,导致机体免疫系统无法有效监测和杀死肿瘤细胞[43];PD-1/PD-L1通路使T细胞向调节性T细胞和衰竭T细胞分化,导致T细胞抗肿瘤作用减弱,当PD-1和PD-L1的结合被它们的抑制剂阻断时,相应的负性调节信息被阻断,T细胞则恢复免疫监测和杀伤作用[44-45]。Fameli A和Gu Y等[40,46]发现T细胞表面PD-1的表达在外周血和肺部组织浸润的T细胞之间存在相关性; Zhang B[47]和Xia L等[48]则证实外周血T细胞(尤其CD4+T、CD8+T)PD-1的表达与NSCLC患者临床特征及肿瘤大小之间存在相关性,同时Gu Y等[46]发现NSCLC患者血清PD-1较无肿瘤患者明显降低,尤其是在NSCLC Ⅰ期患者。NSCLC患者外周血CD4+T、CD8+T细胞PD-1表达水平降低,我们考虑与肿瘤细胞上高表达的PD-L1与其结合有关。因此通过检测外周血CD4+T、CD8+T细胞PD-1表达作为NSCLC患者临床生物指标可以避免肺组织活检侵入性创伤及潜在的并发症风险。

PD-1的表达与晚期NSCLC的CD4和CD8群体的激活和衰竭有关[41]。有报道称,表达PD-1的CD4+T细胞活跃增殖是胃癌患者病情过度进展的可靠标志[49],接受ICI治疗的恶性黑色素瘤患者中,表达PD-1的CD4+T细胞的下降预示着良好的临床结果[50]。PD-1或PD-L1单抗干预后虽然不影响CD4+T细胞的增殖,但显著影响T细胞的细胞毒作用。对于CD4+T细胞数量相近的患者,PD-1的表达水平差异可显著影响患者免疫功能的抗病毒能力。PD-1在CD4+T细胞上的高表达与不良临床结果密切有关,表现为NSCLC患者的OS和PFS明显缩短,这具有预示性,表明该标记物在预测对PD-1通路抑制剂的反应方面具有潜在价值,因为PD-1的高表达与抗PD-L1治疗后的临床结果较差有关[14-16,51]。同时Xia L等[48]也阐明了外周CD4+T细胞特征在预测中国NSCLC患者对抗PD-1治疗反应方面的作用。同时,外周血免疫T细胞上的PD-1表达被认为反映了PD-1/PD-L1轴的激活情况,从而反映了患者对ICIs的敏感性[52]。有研究显示,表达高水平PD-1或PD-L1的CD8+T细胞的存在可预测NSCLC对抗 PD-1治疗的反应[53]。外周循环淋巴细胞作为晚期NSCLC患者的生物标志物有很好的效果;CD8+T细胞在肿瘤侵袭部位的密度是影响ICIs治疗效果的一个预测指标[34,54]。Mazzaschi G等[55]证实CD8+T细胞表达的PD-1与ICIs良好预后有关;Hurkmans DP等[51]同样证实在ICIs早期阻断下增殖的CD8+T细胞表达PD-1与良好的预后有关。因此我们推测,NSCLC患者外周血中的CD4+T、CD8+T细胞的PD-1表达可以作为潜在的预后性和预测性的生物标志物。

六、外周血CD4+T、CD8+T细胞PD-1表达水平作为NSCLC患者临床诊疗指导及评估的展望

PD-1/PD-L1通路在自身免疫调节、肿瘤免疫等方面具有非常重要的作用,是自身免疫性疾病和肿瘤的潜在药物治疗靶点。对于肿瘤而言,活检组织肿瘤细胞上的PD-L1表达是目前唯一用于选择患者对ICIs潜在敏感性的生物标志物,但其需要肿瘤活检组织以及对肿瘤患者免疫状态评估。

综上所述,在病情评估方面,通过检测外周血T淋巴细胞及其PD-1的表达水平可以判断NSCLC患者肿瘤进展情况评估疾病状态、肿瘤治疗效果以及了解患者当前的机体免疫状态等方面提供实验室检测依据。在临床治疗方面,外周血T淋巴细胞PD-1的表达水平可作为一种检测工具来判断PD-1或PD-L1抑制剂药物与肿瘤细胞的结合情况以及评估免疫治疗效果;同时可以作为预测PD-1或PD-L1抑制剂发生不良反应的潜在性生物标志物。