鸡血藤复方提取物对C57小鼠Lewis肺癌实体瘤抑制作用

钟春燕 何宇鸿 李元枢 叶珏颖 何阮滢 曹颖男

(广州新华学院药学院,广东 广州 510520)

非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展与体内特定促癌基因活性增强或抑癌基因活性降低、微环境持续致损、慢性炎症、缺氧、酸性态等因素有关。中医理论认为癌症的发生发展主要是由于正气虚损、阴阳失衡,致使气滞血瘀、痰凝毒聚导致的〔1〕,治疗上以扶正袪邪为主,如益气、养血、滋阴、温阳,辅以软坚散结、活血化瘀、化痰利湿、清热解毒等疗法,实现标本兼治〔2〕。鸡血藤是一种传统的活血补血中药,具有活血补血、调经止痛、舒筋活络的功效,为豆科植物密花豆的干燥藤茎〔3〕,其所含化学成分有黄酮、酚、木脂素、甾醇及挥发油等,其除了活血、促进造血的功效外,其还有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多样药理学活性〔4～8〕。鸡血藤的黄酮类组分和缩合鞣质对肿瘤细胞有明显的抑制作用〔9～12〕,该药主要通过细胞凋亡和自噬、肿瘤细胞周期阻滞和抑制肿瘤转移发挥抗肿瘤作用〔13〕。本实验对鸡血藤复方提取物进行抗肿瘤及免疫调节初步验证,为进一步开发应用中药抗肿瘤价值提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1材料及动物 lewis肺癌细胞株(中国科学院细胞库/干细胞库),复苏培养,以107/只接种于C57小鼠腋下用于试验。50只SPF级雄性健康C57小鼠,购入时4周龄。体质量18～20 g,购自中山大学实验动物中心东校区,实验动物合格证号为:NO.44008500014488。实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2016-0112,饲养于中山大学实验动物中心SPF级屏障环境动物房,温度20～25 ℃,湿度40%～70%,换气次数>10次/h,饲养密度:5只/笼,照明时间:12 h,自由摄食饮水〔饲料,生产单位:广东省医学实验动物中心,生产许可证:SCXK(粤)2008-0002〕。

1.2药材 在前期研究基础上〔14〕根据君臣佐使进一步优化,得到中药复方:鸡血藤20 g(批号2002003),柴胡15 g(批号2002002),蚤休15 g(批号2002006),莪术15 g(批号2004062),蜈蚣10 g(批号2002008),黄芪30 g(批号2002021),均购自清远医农坤载大药房有限公司。药材粉碎,称重,第1次提取:将称好的药材置于圆底烧瓶中,加入10倍的水进行回流提取2 h(沸腾才开始计时),同时收集挥发油,用二层100目纱布进行过滤。第2次提取:往滤渣中加入8倍量的水进行提取,时间为1.5 h(沸腾才开始计时),同时收集挥发油,二层100目纱布过滤,合并二次滤液进行抽滤。抽滤液用旋转蒸发仪进行浓缩,浓缩到一定程度(约2%滤液),倾出用水浴锅继续浓缩,浓缩到每ml含生药量约3.2 g,加入挥发油合并为复方提取物,置于4 ℃冰箱待用。

1.3主要仪器及试剂 主要仪器:冷冻离心机(MIKRO 200R,Andreas Hettich GmbH &Co.KG)、Thermo Multiskan Go全波长酶标仪(美国Thermo Fisher公司);BSA124-CW电子天平〔赛多利斯(上海)贸易有限公司〕。主要试剂:生理盐水水(山东华鲁制药有限公司,批号:016101215),小鼠干扰素(INF)-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(批号:H11017904),白细胞介素(IL)-4 ELISA检测试剂盒(批号:L11017905)购自武汉华美生物科技有限公司。

1.4分组与给药途径 随机分为5组,每组10只,模型组灌胃给予溶媒0.2 ml/10 g,阳性药组腹腔注射环磷酰胺30 mg/kg。鸡血藤复方提取物按照该组方的1、2、4倍于临床等效剂量换算为小鼠剂量〔15〕:低、中、高剂量组灌胃给予6.25、12.50、25.00 ml原液/kg。

1.5荷瘤鼠制备 取复苏的鼠源Lewis肺癌细胞5管,每管数量约为1×107,接种至C57小鼠腋下皮下,让其自然生长,约14 d,长到直径1 cm以上。

1.6肿瘤接种及给药 选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤鼠,颈椎脱臼处死,在无菌条件下(超净台或接种罩),用新洁尔灭消毒皮肤,切开皮肤,剥离肿瘤。将瘤组织剪成1.5 mm3左右,用套管针接种于受试小鼠双侧腋窝皮下,次日按体质量随机分组,同时开始给药,各组均每日给药1次,连续 14 d。

1.7测定指标 (1)各组小鼠于给药前及给药后7、14 d进行体质量称量;(2)实验结束后,各组小鼠摘眼球取血约0.6 ml,分离血清,冷藏备用,用于测定INF-γ、IL-4;又取血约0.4 ml抗凝,用流式细胞仪进行CD4+、CD8+检测。(3)处死并解剖各组小鼠,分离出胸腺和脾脏,分别称重,计算脏器指数,脏器指数=胸腺或脾脏(mg)/小鼠体质量(g)。(4)各组小鼠剥除完整的肿瘤块并马上称重量,计算肿瘤抑制率,肿瘤抑制率=(空白组平均瘤重-给药组平均瘤重)/瘤重×100%。(5)动物病理检测:每组小鼠剥取Lewis肺癌实体瘤后,标本在10%甲醛溶液中固定完全后取部分肿瘤组织,经脱水、包埋、切片,苏木素-伊红(HE)染色,用普通光学显微镜观察,结合参考文献对组织病理病变分级进行判定〔16〕,组织病理病变分级标准:组织坏死0%～5% 1分,6%～15% 2分,16%～30% 3分,31%～60% 4分,61%～100% 5分。组织病理炎症细胞浸润程度分级标准:正常(无炎症细胞浸润)0分,最轻度(浸润<1%)1分,轻度(浸润1%～25%)2分,中度(浸润26%～50%)3分,重度(浸润51%～75%)4分,超重度(浸润76%～100%)5分。

1.8统计学处理 采用GraphPad Prism6.0生物统计学软件进行方差分析、Dunnett多重比较、Kruskal-Wallis秩和检验。

2 结 果

2.1鸡血藤复方提取物对体质量的影响 如表1所示,与模型组比较,给药7、14 d后,各给药组体质量均有不同程度减轻,其中高剂量组、阳性药组体质量减轻均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

表1 各组体质量和血清IFN-γ、IL-4及瘤重、肿瘤抑制率比较

2.2鸡血藤复方提取物对血清中免疫细胞因子INF-γ、IL-4的影响 如表1所示,与模型组比较,低、中、高剂量组血清中INF-γ、IL-4含量均不同程度升高,但差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3鸡血藤复方提取物对小鼠瘤重、肿瘤抑制率的影响 如表1所示,与模型组比较,各给药组小鼠瘤重均不同程度降低,其中高剂量组、阳性药组瘤重降低差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

2.4鸡血藤复方提取物对胸腺指数、脾脏指数的影响 如表2所示,与模型组比较,阳性药组脾脏指数有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),胸腺重量、胸腺指数、脾脏指数均显著下降(P<0.05)。

表2 各组胸腺指数、脾脏指数、病理评分比较

2.5肉眼及镜下观察小鼠肿瘤病理学改变 肉眼可见:模型组肿瘤体积较大,形态不规则,质脆易破,切开后极少见肿瘤组织坏死;低剂量组肿瘤体积较模型组略小,形态不规则,切开后少见肿瘤组织坏死;中剂量组肿瘤体积较模型组减小,形态不规则,切开后可见肿瘤组织坏死;高剂量组肿瘤体积较模型组明显减小,形态不规则,切开后可见较多肿瘤组织坏死;阳性药组肿瘤体积较模型对照组明显减小,切开后可见大量肿瘤组织坏死。见图1。与模型组相比,高剂量组和阳性药组的组织坏死程度明显增多(P<0.05,P<0.01)。见表2。

图1 肉眼观测各组肿瘤形态

经显微镜下观察得知:模型组肿瘤镜下见细胞密集排列,细胞核肥大、畸形,染色深,核染色分布不均匀,病理性核分裂现象多见,异型性明显。低剂量组肿瘤镜下见细胞密集排列稍减低,细胞核肥大、畸形,染色深,核染色分布不均匀,病理性核分裂现象多见,异型性明显;肿瘤组织间质中可见淋巴细胞浸润。中剂量组肿瘤镜下见细胞密集排列减低,染色质浓缩边集,病理性核分裂现象较多,异型细胞较多;部分瘤组织破坏;肿瘤组织间质中可见淋巴细胞浸润。高剂量组肿瘤镜下见细胞密集排列减低,病理性核分裂现象降低,异型细胞降低;部分瘤组织破坏;肿瘤组织间质中可见淋巴细胞浸润。阳性药组肿瘤镜下见细胞密集排列明显减低,病理性核分裂现象降低,异型细胞降低;大量瘤组织破坏;肿瘤组织间质中可见大量炎细胞浸润。见图2。

图2 各组肿瘤病理学改变(HE染色)

3 讨 论

肿瘤的发生是细胞生长异常、分化失控的结果,目前认为是癌基因、肿瘤抑制基因、凋亡调节基因和DNA修复调节基因等多个基因联合发生突变造成的。 近年来,临床研究指出,恶性肿瘤发病可能和细胞因子具有密切关系,机体遭受损伤后免疫系统会诱导生成炎症细胞,大量释放炎性因子、趋化因子等,产生肿瘤微环境,加速肿瘤血管生成、增殖、细胞浸润及转移等〔17〕。中医药方剂往往有多种有效成分可针对肿瘤的多种发病机制发挥作用,调控多种信号通路,抑制多种炎症因子的优势〔18〕。中医药在现代肿瘤治疗中起到增效减毒、预防复发转移等补充治疗作用〔19〕。鸡血藤是一味养血活血中药,中医古籍记载用于治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症。鸡血藤具有促进骨髓造血、改善血流动力学、降压、双向调节免疫功能、抗病毒作用。有研究报道,鸡血藤对小鼠移植性H22肝癌、Lewis肺癌、S180肉瘤均有一定的抑制作用,并且鸡血藤在抗肿瘤的同时,具有增加白蛋白水平、增强免疫、减轻骨髓抑制的作用。本实验结果提示,鸡血藤复方提取物可以抑制肿瘤生长。INF-γ是重要的免疫应答调节剂,由T辅助(Th)1细胞分泌,它能激发细胞介导的免疫反应来杀灭细胞内病原菌。可在体内增强自然杀伤(NK)细胞和T细胞的免疫反应〔20,21〕。激活单核巨噬细胞,增强抗原提呈,促进Th0细胞向Th1分化〔22〕。同时也可以通过调节细胞周期、抑制血管生成、增强肿瘤的免疫原性、调节肿瘤微环境等途径抑制肿瘤发生〔23〕。IL-4由Th2细胞分泌,激发体液免疫,产生抗体,杀灭细胞外病原菌〔24〕。IL-4作用包括刺激B细胞、促使B细胞向浆细胞分化及诱导B细胞分泌免疫球蛋白(Ig)E,促使Th细胞向Th2型细胞分化,并抑制Th1型细胞产生。本实验INF-γ和IL-4无统计学意义的原因可能是药物剂量仍未到适宜浓度,后续可调整剂量进行测试。生物反应调节剂与传统的化疗药物相比,细胞毒性更小,可增强机体免疫功能,对肿瘤细胞的特异性和选择性更强。研究发现,通过免疫治疗的方法成了肺癌新的治疗方法,化疗与免疫治疗也有一定的协同增强效果,进一步增加抗肿瘤效果〔25～28〕。本实验结果提示,环磷酰胺在发挥抗肿瘤作用时,会明显对人体免疫系统造成伤害,导致免疫功能下降,患者体质较差,易发生并发症,增加治疗难度。本研究结果提示,鸡血藤复方提取物不会对人体免疫系统造成损伤,甚至对免疫系统有所增强,该复方可能利于辅助抗肿瘤治疗,提高抗肿瘤效果,减轻放化疗对身体造成的毒性副作用。

综上,鸡血藤复方提取物具有抑制肿瘤生长的作用,其作用机制可能是作为生物反应调节剂,参与调节免疫功能、促进肿瘤细胞死亡、抑制肿瘤细胞增殖等相关。