超高效液相色谱-串联质谱法同时测定肉类中15种唑类抗菌药物

◎ 许庆鹏，吴雅芝，李 聪，綦 艳，郦明浩，李 皓，容培森

（广东产品质量监督检验研究院，广东 佛山 528300）

我国作为畜牧业大国，近年养殖业发展突飞猛进，生产能力也显著提高，在结构优化、产业升级等方面取得了一定的成就。在非洲猪瘟和其他动物源性疾病的影响下，一些生产企业、养殖户等会采取相关的药物治疗和预防，使用或者过量使用一些高效但非法的药物，例如，磺胺类、喹诺酮类、四环素类兽药等[1-2]。唑类抗菌药物同样容易被滥用，该药物不仅具有抗厌氧菌、广谱、杀菌作用强，而且价格相对低廉，治疗效果好，可用于防治球虫病、猪出血性炎、滴虫病等疾病。此外，此类药物使用后可增加动物体重，大受养殖户和生产企业的青睐[3-5]。然而，由于该类药物对人体有危害，且滥用后容易产生耐药性，一经食用后易造成食品安全事故，危害公共卫生安全[6-8]。在食品动物中，洛硝达唑和替硝唑被列为禁止使用的药物，地美硝唑和甲硝唑可以作为治疗用途，但不得在动物性食品中检出[9-10]。

到目前为止，针对唑类抗菌药物的检测有很多，主要的研究多与可食性动物产品、动物相关组织和动物的排泄物等有关。检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、有酶联免疫法等[11-13]。其中，高效液相色谱法和气相色谱法的检测时间比质谱的检测时间要长，需要有较高纯度的样品，且受杂质影响大。高效液相色谱-质谱联用技术由于高分辨率，可以更加灵敏地检测出目标物质，在现代仪器的更新迭代发展中逐渐成为一种炙手可热的检测手段。本研究主要针对肉类中唑类抗菌药物残留的测定方法，建立高效液相色谱质谱联用方法，在确保肉类供给满足的前提下，促进生产过程和销售使用的质量安全，为相关监管职能部门提供强有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器与设备

SCIEX QTRAP 4500 超高效液相色谱-串联质谱系统，美国 AB SCIEX 公司；Sigma 3-18K高速冷冻离心机；超声波清洗机；漩涡混合器；去离子水发生器；氮气浓缩仪。

1.1.2 材料与试剂

猪肉、鱼肉，购于佛山市超市及农贸市场；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯试剂）；其他试剂均为分析纯。甲硝唑、益康唑、奥硝唑、克霉唑、替硝唑、酮康唑、氟康唑、新康唑、咪康唑、异丙硝唑、苯硝咪唑、洛硝哒唑、氯甲硝咪唑、羟基甲硝唑、联苯苄唑(纯度≥98%），德国Ehrenstorfer公司。

1.2 标准溶液的配制

精确称取15种唑类药物标准品各10 mg于10 mL的棕色容量瓶中，用纯乙腈溶解并定容，配制成各唑类药物为1 mg/mL的单标标准储备液，置于-18 ℃避光保存。再从上述15种单标标准储备液中精确吸取0.1 mL于10 mL的棕色容量瓶中，用50%乙腈水溶液定容，配制成浓度为10 μg/mL的混合标准中间储备液，并置于-18 ℃避光保存。以1%甲酸乙腈溶液为稀释液，对混合标准中间储备液进行稀释，并配制成相应质量浓度范围的标准系列溶液。采用同样方法，得到基质混合标准系列工作溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

精确称取2.00 g (精确至0.01 g) 捣碎后的组织样品于50 mL的具塞离心管中，加入10 mL的1%甲酸乙腈溶液，置于涡旋器上涡旋混匀30 s，加入1 g NaCl和4 g NaSO4，振荡1 min，充分溶解后，超声10 min，然后移至高速冷冻离心机，于9 000 r/s离心3 min，取上清液5 mL于氮吹管中，使用氮气浓缩仪于40 ℃吹干，加入1 mL的1%甲酸乙腈溶液溶解，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤于进样瓶中。待UPLCMS/MS测定。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Waters Acuity UPLC BEH C18反相色谱柱 (150 mm×1.0 mm, 1.7 μm) ；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈；流速为0.25 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；运行时间10 min；梯度洗脱程序：0～2.0 min，90% A；2.0～5.0 min，90%～70% A；5.0～6.0 min，70%～40%A；6.0～7.5 min，40%A；7.5～8.0 min，40%～90%A；8.0～10.0 min，90%A。

1.3.3 质谱条件

电离方式：电喷雾离子源正离子模式（ESI+）；扫描方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：5 500 V；气帘气（CUR）：35 L/min（氮气）；雾化气（ GS1）：45 L/min；辅助气（GS2）：45 L/min；离子源温度（ TEM）：500 ℃。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的优化

甲醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷和一些混合溶剂,通常用作化合物的提取剂，二氯甲烷和三氯甲烷具有一定毒性和危害性，因此一般不作为提取剂使用。唑类药物及其代谢产物的极性较大，采用极性较强的甲醇和乙腈提取，提取效率较高。乙酸乙酯作为一种极性较低的提取剂，对于极性大的唑类药物的提取效率偏低。提取剂在弱酸性下，能够更好地破坏组织结构，使目标物游离出来，从而提高提取率。因此，本文采用甲醇、0.1%甲酸（V/V）甲醇、乙腈和0.1%甲酸（V/V）乙腈作为提取剂进行比较。不同的提取剂对目标物的提取存在一定的差异。经过实验考察，甲醇和0.1%甲酸甲醇对15种唑类药物的提取回收率低于60%，乙腈和0.1%甲酸乙腈的回收率可达75%。由于0.1%甲酸乙腈对15种唑类药物有更好的分离效果，因此，选择0.1%甲酸乙腈作为本实验的提取剂。

2.2 色谱条件优化

本研究对反相色谱柱Waters Acuity UPLC BEH C18(150 mm×1.0 mm, 1.7 μm)和Waters Acuity UPLC HSS T3(150 mm×1.0 mm, 1.8 μm)，以及对将目标物质进行分离的流动相（乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-10 mmol乙酸铵、乙腈-0.1%甲酸水）的效果进行了比较和评价。对流动相体系进行探究，在甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水流动相体系中，羟基甲硝唑和甲硝唑有比较明显的拖尾，峰型差；在乙腈-10 mmol乙酸铵流动相体系中，基线噪音较大；在乙腈-水流动相体系中，15种目标化合物的分离度和响应值都有较好的效果，在乙腈-0.1%甲酸水流动相体系中，15种目标化合物的峰型对称，分离度和响应度更好，最终以乙腈-0.1%甲酸水作为分离目标物质的流动相体系。考察比较不同色谱柱的分离效果，实验表明，Waters Acuity UPLC BEH C18 (150 mm×1.0 mm,1.7 μm)能够得到15种化合物峰型不拖尾，峰尖且对称，分离效果好（如图1）。

图1 15种药物的总离子流图

2.3 质谱条件优化

将100 μg/L的15种混合标准溶液以流动注射的方式注入质谱仪中，考察正离子模式下15种唑类药物的响应值，实验结果表明，所有目标物在正离子模式下响应更好。通过一级质谱全扫描，分别确定15种药物的母离子，在此基础上，分别以母离子为研究目标，进行二级质谱扫描，确定了目标化合物对应的离子碎片，并在所有的离子碎片中选取目标药物的定量离子和定性离子，即干扰小、离子丰度较高的两个碎片离子，其中，离子丰度高的为定量离子。通过优化去簇电压（DP）和碰撞电压（CE），确定每个离子的最优去簇电压和碰撞电压。15种化合物的离子对参数见表1。

表1 15种化合物的质谱参数、线性关系、检出限和定量限表

2.4 方法的线性关系和灵敏度

为消除基质效应的影响，本实验以工作液为使用试剂配制基质标准曲线。如表1实验结果所示，15种化合物在相应质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.995。将低浓度的标准溶液加入空白基质中，以信噪比(S/N)≥3时，作为本方法的检出限(LOD)；以信噪比(S/N)≥10时，作为本方法的定量限(LOQ)。

2.5 回收率和精密度

以均质后的鱼肉和猪肉为样品基质，进行3水平6平行的加标回收实验，进一步考察实验的准确度和精密度，结果见表2。由表2可知，在不同的加标水平下，15种化合物在鱼肉和猪肉中的平均回收率为76.4%～102.1%，相对标准偏差为0.2%～10.1%。

表2 鱼肉和猪肉样品中15种药物的加标回收率和RSD表（n=6）

2.6 实际样品检测

本研究在佛山市各大超市和农贸市场购买了15份鱼肉和15份猪肉进行检测，在30批次的样品中均未检出15种抗菌类药物残留。

3 结论

本研究建立了针对肉类中甲硝唑、益康唑、奥硝唑等15种高风险唑类抗菌药物的高效液相色谱串联质谱测定方法，该方法简单、有效、灵敏度高，可同时准确完成15种唑类抗菌药物在肉类中的检测。