浅析蛋白质沉淀剂对乳制品中环己基氨基磺酸钠含量的测定影响

◎ 高元元

（云南省食品药品审核查验中心（云南省疫苗检查中心）， 云南 昆明 650031）

环己基氨基磺酸钠为非营养型甜味剂，又名甜蜜素，过量摄入会损害人体肝脏和神经系统[1]。甜蜜素的致癌作用一直为人们所争议[2]。根据GB2760—2014《食品安全标准 食品添加剂使用标准》，甜蜜素可在冷冻饮品、果酱、蜜饯凉果、复合调味料、面包、糕点以及配制酒等19类食品中限量范围使用[3-5]。由于甜蜜素禁止在美、日、英以及加拿大等40多个国家使用，而我国又是全球最大的甜蜜素出口国，因此，甜蜜素超标问题将影响我国食品出口质量[6]。高效检测食品中的甜蜜素含量，确保食品中甜蜜素含量符合国家标准的意义重大。对于蛋白质含量较高的乳制品，为了解决样品前处理中过滤速度慢等问题，试验过程中使用蛋白质沉淀剂（即亚铁氰化钾和乙酸锌溶液1∶1）,生成的亚铁氰化锌沉淀吸附干扰物质，可以有效去除蛋白质。同时，环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠在硫酸介质中反应生成环己醇亚硝酸酯和环己醇。随着时间延长，环己醇亚硝酸酯会逐渐转化成环己醇[7]。亚铁氰化钾及乙酸锌蛋白沉淀剂的加入可能会对上述衍生化反应产生影响，也有可能对产物的稳定性造成影响。因此，本试验测定蛋白质沉淀剂的加入，对样品中甜蜜素含量测定造成的影响以及两者间回收率的差异。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦Agilent GC-7890B（FID）、环己基氨基磺酸钠标准品：Dr.Ehrenstorfer GmbH（99.1%）、正庚烷、亚铁氰化钾、乙酸锌、亚硝酸钠、硫酸。

1.2 样品

乳粉、风味酸奶、酸奶（市售）。

1.3 试验方法

1.3.1 环己基氨基磺酸钠衍生物定性及标准曲线绘制0.050 13、0.100 26、0.200 52、0.300 78、0.401 04 、0.501 3 mg/mL系列浓度的标准溶液，移取标准溶液10 mL于50 mL带盖离心管中，冰浴5 min。准确加入5.00 mL正庚烷，2.5 mL亚硝酸钠溶液，2.5 mL硫酸溶液，盖紧离心管后摇匀，尽快置于冰浴30 min。加入2.5 g氯化钠，混合1 min，4 ℃离心（3 000 r/min）10 min，吸取1 μL上清液上机测定。对比研究确定衍生物目标峰，并绘制标准曲线。

1.3.2 不同类别样品添加回收试验

分别称取2份乳粉、酸奶、风味酸奶样品置于50 mL带盖离心管中。其中，样品乳粉、酸奶样品添加0.50 mg标准溶液，风味酸奶样品中添加0.30 mg标准溶液；一份样品中再添加3 mL蛋白质沉淀剂，另一份样品作为对照组不添加蛋白质沉淀剂。加20 mL水，摇匀，超声提取20 min，4 ℃离心（3 000 r/min）10 min，过滤，收集滤液并定容至50 mL。准确移取试样溶液10 mL ，按1.3.1操作，计算回收率。

1.3.3 气相色谱条件

色谱柱：TG-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升温：初温55 ℃保持3 min，10 ℃/min升温至90 ℃保持0.5 min，20 ℃/min升温至200 ℃保持3 min。进样口、检测器温度：230 、260 ℃。进样方式：分流进样，分流比为2∶1。

2 结果与分析

2.1 环己基氨基磺酸钠衍生物定性及绘制标准曲线

以甜蜜素浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标，建立标准曲线。甜蜜素衍生产物有2个色谱峰，甜蜜素(环己基氨基磺酸钠)和亚硝酸钠在硫酸酸性条件下反应生成环己醇，环己醇在酸性条件下又继续与亚硝酸钠发生酯化反应生成环己醇亚硝酸酯。因为成酯反应在一定反应条件下是动态平衡，所以正己烷提取物中会同时有环己醇亚硝酸酯和环己醇存在，并且在放置过程中，环己醇亚硝酸酯与环己醇的平衡会移动。因此，主产物峰会随着时间和反应条件变化逐渐转变为副产物峰，但是主副产物的峰面积之和基本保持不变，主产物和副产物的峰也有一定的线性关系，用组校准的方法做出的标准曲线1使检测结果更为准确（如图1所示）。

图1 甜蜜素标准曲线图

2.2 气相色谱图比较

图2为样品色谱图，显示甜蜜素含量为0；图3是空白对照色谱图；图4为标准品色谱图，甜蜜素保留时间为4.393 min；图5为加入标准品和3 mL蛋白质沉淀剂的气相色谱图，甜蜜素的保留时间为4.394 min。结果显示，加入蛋白质添加剂的保留时间仍停留在4.3 min以内，表明对甜蜜素的测量不会造成影响。

图2 样品气相色谱图

图3 空白气相色谱图

图4 加入标准品气相色谱图

图5 加入标准品和3 mL蛋白质沉淀剂气相色谱图

2.3 蛋白质沉淀剂对测定乳制品中甜蜜素回收率的影响

市售乳粉、风味酸奶、酸奶加入不同量的甜蜜素与蛋白沉淀剂，回收率结果见表1；精密度试验结果见表2。

表1 甜蜜素回收率试验结果表

表2 精密度试验（n=6）结果表

如表1、表2所示，未加入蛋白质沉淀剂时，乳粉、风味酸奶、酸奶样品回收率分别为96%、94%、96%，加入蛋白质沉淀剂后，对应回收率分别为99%、100%、100%，由此可见，蛋白质沉淀剂的加入，提高了样品回收率。此外，在样品处理过程中添加蛋白质沉淀剂亚铁氰化钾和乙酸锌溶液，可使试样澄清，有效消除溶液浑浊现象，提高处理效率；相对标准偏差（变异系数）均＜10%，证明该方法准确度高，精密度和重复性良好，满足试验要求。

3 结语

本研究表明，加入蛋白质沉淀剂可以有效提高样品回收率，回收率可达100%，使检测结果更为准确。同时，亚铁氰化钾和乙酸锌合成的沉淀剂除蛋白能力较强，可有效减少测试样品对色谱柱的损坏。