百香果可可毛色二孢茎基腐病菌产孢条件研究

黄艳花 黄 强 覃连红 张燕杏 崔忠吉 蒙 成*

（1广西农业职业技术大学，广西南宁 530007；2广西现代农业技术展示中心，广西南宁 530007）

百香果（Passiflora edulisSims）具有较高的营养价值和药用价值[1-3]，在我国亚热带地区被列为重点开发作物之一，近年来广西、福建和贵州等地百香果的种植面积迅速扩大[4]。可可毛色二孢菌（L. theobromae）是子囊菌门座囊菌纲葡萄座腔菌目葡萄座腔菌科的一种植物病原菌，病原菌引起的植物病害寄主范围广，可侵染茶树[5]、猕猴桃[6]、橡胶树[7]、春芋[8]、桉树[9]、肉桂[10]、白木香[11]、毛葡萄[12]、南洋楹[13]、栾树[14]、槟榔[15]、剑麻[16]等500 多种植物，致病时呈现叶斑、溃疡、梢枯、枝枯、根腐、果腐、流胶、坏死等症状[17]，对农业产业造成了重大经济损失。黄艳花等[18]报道了可可毛色二孢菌引起百香果茎基腐病，在高温高湿条件下，受该病原菌为害，百香果植株可在3～7 d 失水萎蔫死亡，严重年份部分连作果园病株死亡率高达50%～60%[18]。可可毛色二孢菌在常规培养条件下分生孢子难产生且周期长，而获得病原菌大量分生孢子是开展基因功能、侵染过程、致病机理、药剂生物测定和寄主抗病品种抗性鉴定等研究的关键环节，因此，研究可可毛色二孢菌产孢适宜条件，对进一步研究百香果茎基腐病及可可毛色二孢菌具有重大意义。

关于可可毛色二孢菌产孢条件的描述，薛振南等[10]认为，在连续光照的OMA 培养基上，该菌产孢较快且较多。史国英等[13]认为，在pH 为3～4的PSB 培养基上培养30 d 后可产生子座及分生孢子。迄今为止，国内外系统性对可可毛色二孢菌（L. theobromae）产孢因素的研究尚处于空白，为获得产量高的可可毛色二孢菌分生孢子，笔者以查氏培养基粉、燕麦琼脂培养基粉、玉米粉琼脂培养基粉、琼脂粉、PCA 培养基为主要材料，以百香果枝条小节、百香果枝条碎粒、百香果煮枝液、甘露醇、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C 等为辅料，单因素组配32 种培养基开展产孢量试验，同时对不同温度、pH、光照、植物枝条等影响产孢的因素进行进行了较深入的研究，以期掌握可可毛色二孢菌简易、快速、大量获取其分生孢子产孢技术因素，也为此类真菌的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L.theobromae），由广西农业职业技术大学植保实验室分离、鉴定并保存。

1.2 供试培养基

供试培养基，分别由山东拓普生物工程有限公司生产的查氏培养基粉、燕麦琼脂培养基粉、玉米粉琼脂培养基粉和北京索莱宝科技有限公司生产的琼脂粉、自制PCA 培养基为主要材料，以百香果枝条小节、百香果枝条碎粒、百香果煮枝液、甘露醇、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C 等为辅料，单因素组配32 种培养基，以PDA 培养基为对照（表1）。

表1 培养基配方

枝条小节：选取长势一致百香果绿枝条切3.0～4.0 cm 小段，于121 ℃高压灭菌锅灭菌20 min，置于70 ℃烘箱24 h烘干，得到灭菌的百香果枝条小节备用。

枝条碎粒：选取长势一致百香果绿枝条剪0.2 cm 左右碎粒，于121 ℃高压灭菌锅灭菌20 min，置于70 ℃烘箱24 h烘干，得到灭菌的百香果枝条碎粒备用。

煮枝液：选取长势一致百香果绿枝条，去掉叶片和嫩梢，切1.0～2.0 cm 小段，称取30 g 枝条节加入水中熬制，大火煮开，小火熬煮1 h，加水定容至100 mL，获得百香果煮枝液备用。

1.2.1基础培养基配方CMA（玉米粉琼脂培养基粉2.2 g+水100 mL）；Czapek（查氏培养基粉5.0 g+水100 mL）；OA（燕麦琼脂培养基粉7.3 g+水100 mL）；WA（琼脂粉2.0 g+水100 mL）；PCA培养基（土豆20.0 g+蔗糖2.0 g+琼脂粉2.0 g+水100 mL）；PDA 培养基（土豆20.0 g+葡萄糖2.0 g+琼脂粉2.0 g+水100 mL）。按常规配制方法配制好后经121 Pa高压灭菌25 min备用。

1.2.2植物组织培养基配制方法取配方中所需的基础培养基倒入平板，每皿15 mL，冷却后加入2～3节枝条小节，使枝条大部分暴露在平板培养基外面，得到枝条小节培养基。在超净工作台中，每100 mL 平板培养基中加入30.0 g 枝条碎粒，混匀后倒入平板，每皿15 mL，得到枝条碎粒培养基。

1.2.3合成培养基配制方法以煮枝液或基础培养基为溶液加热，添加配方中所需成分，充分溶解混匀，经121 Pa高压灭菌25 min备用。

1.3 供试仪器

供试培养箱为珠江牌培养箱，型号：LRH-250-GSB1。

1.4 病原菌产孢条件筛选

1.4.1不同培养基对病原菌产孢量的影响参考罗利娟等[19]的方法并改进，单因素组配32 种营养培养基进行产孢量试验。分植物组织培养基组和合成培养基培养基组，分植物源培养基组10个处理（表1 中K1、K8、k15、K22、K31；K2、K9、K16、K23、K32），纯平板培养基组22 个处理（表1 中K3、K4、k5、K6、K7；K10、K11、K12、K13、K14、K16、K17、k18、K19、K20；K21、K24、K25、K26、K27、K128、K29、k30），每处理4次重复。供试菌株在PDA 培养基上扩繁3 d，用6 mm 打孔器取菌饼，接到各培养基处理平板中央，置于28 ℃、12 h 黑暗、12 h 光照（光照强度300 lx）的培养箱中培养，7 d 后拍照，观察记录载孢体形态；第10 天测定产孢量；第20 天测定孢子成熟比例。

1.4.2不同温度对病原菌产孢量的影响参考孙光军等[20]的方法并改进，以K20和K25培养基为供试培养基，供试菌株在PDA 培养基上扩繁3 d，用6 mm 打孔器取菌饼，接种到培养基处理平板中央，分别在10、15、20、25、30和35 ℃共6个温度梯度，黑暗12 h、光照12 h（光照强度300 lx）条件下培养，每处理4 次重复，7 d后拍照，观察记录载孢体形态，分别在第10、18天测定产孢量。

1.4.3pH 值对病原菌产孢量的影响参考孙光军等[20]的方法等并改进，以K20培养基为供试培养基，配置1.0 mol/L NaOH、1.0 mol/L HCl 灭菌，在无菌条件下用NaOH 和HCl 把K20培养基pH 分别调为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0共10个梯度，倒入培养基平板，待冷却后将直径6.0 mm 的病原菌菌饼接种于不同pH 平板中央，每处理4 次重复，置于28 ℃、黑暗12 h、光照12 h（光照强度300 lx）培养箱中培养，7 d 后拍照，观察记录载孢体形态；第10天测定产孢量。

1.4.4不同光照对病原菌产孢量的影响参考孙光军等[20]的方法等并改进，以K20和K25培养基为供试培养基，将6 mm病原菌菌饼分别接种于K20和K25培养基平板中央，进行全黑暗（0 lx）、半光半暗（黑暗12 h、光照12 h，光照强度300 lx）、全光照（光照24 h，光照强度300 lx）3种光照环境处理，全黑暗处理使用4 层锡箔纸包裹遮光，每处理4 次重复，置于28 ℃人工气候箱培养，7 d后拍照，观察记录载孢体形态；第10天测定产孢量。

1.4.5不同植物枝条对病原菌产孢量的影响以K31培养基为基础培养基，分别添加荔枝（编号T1，下类同）、桑树（T2）、扶桑（T3）、柑橘（T4）、桂花树（T5）、木瓜（T6）、杧果（T7）、阳桃（T8）、李树（T9）、黄皮（T10）、坚果（T11）、黄素梅（T12）、龙眼（T13）、百香果（T14）、葡萄（T15）15 种植物枝条小节，制成15 种不同植物的植物源培养基，每种植物源培养基为1 个处理，每处理4 次重复，将6 mm 病原菌菌饼分别接种于培养基中央，置于28 ℃人工气候箱培养，7 d 后拍照，观察记录载孢体形态；第10 天测定产孢量。

1.5 病原菌产孢量测定

将10 mL 无菌水加入产孢培养基中，用一次性灭菌涂布器轻磨培养基上的菌落，碾碎载孢体，用双层灭菌擦镜纸过滤，洗下分生孢子，用血球计数板统计产孢量。

1.6 病原菌孢子成熟度的测定

显微镜下观察孢子成熟情况，分生孢子单胞无色计为未成熟，分生孢子双胞褐色计为成熟，每处理连续统计孢子100 个以上，4 次重复，用计数器统计分生孢子成熟率。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对病原菌产孢量的影响

2.1.1植物组织培养基从表2、图1中可知，百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）在5 种枝条小节培养基中均产生载孢体，除K8（CMA+枝条）培养基无分生孢子外，其他4个处理均产生分生孢子。在K31（PCA+枝条）培养基上，载孢体粒大、量多、凸出，产生的分生孢子量为14.91×104 个/cm2，极显著高于其他培养基；在K1（OA+枝条）培养基上，载孢体粒大、量中等、凸出，产生的分生孢子量为11.54×104 个/cm2，极显著高于K22（Czapek+枝条）和K15（WA+枝条）培养基。百香果可可毛色二孢茎基腐病菌在5种枝条碎粒培养基中均产生载孢体及分生孢子，在K2（OA+碎粒）培养基上产生的载孢体粒大、量多，半埋生，产生的分生孢子量为28.56×105 个/皿，极显著高于其他培养基；在K32（PCA+碎粒）培养基上，载孢体粒大、量多、多数凸出，产生的分生孢子量为22.10×105 个/皿，极显著高于K16（WA+碎粒）、K23（Czapek+碎粒）、K9（CMA+碎粒）培养基；K9（CMA+碎粒）产生的分生孢子量极显著低于其他处理的产孢量。

图1 病原菌在部分培养基上生长7 d的状态

表2 不同植物组织培养基对病原菌产孢量的影响

在10 种植物组织培养基上培养20 d 后，K9（CMA+碎粒）产生的分生孢子成熟率为90.91%，其他处理孢子成熟率在1.11%～29.41%。

可知，百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）在植物组织培养基上容易产生分生孢子，以OA、CPA+枝条组织的培养基产孢量较高，WA、Czapek+枝条组织的培养基产孢量次之，CMA+枝条组织的培养基产孢量较少或不产孢。

2.1.2合成培养基将供试菌株分别接种在22种合成培养基上，培养7 d 后观察发现15 种合成培养基产生载孢体，7 种合成培养基没有产生载孢体，PDA（CK）培养基没有产生载孢体（图1）；培养10 d后测定发现，没有产生载孢体的培养基都没有产生分生孢子，K14和K19号培养基上产生载孢体但没有产生分生孢子。K4（燕麦培养基粉7.3 g+煮枝液100 mL+甘露醇2.5 g）培养基载孢体粒较大、多、多数立生，产生的分生孢子量最多，为5.27×105个/皿，极显著高于其他培养基；K6（燕麦培养基粉7.5 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）和K7（燕麦培养基粉7.5 g+煮枝液100 mL+B130 mg、维生素B21.5 mg、维生素B60.2 mg、维生素C 100 mg）培养基载孢体粒较大、多、多数立生，产生的分生孢子量排第2、3位，分别为4.65×105个/皿和4.62×105个/皿，极显著高于除K4以外的培养基；K20（白琼脂粉2 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）培养基载孢体粒大、多、立生，产生的分生孢子量为2.91×105个/皿，排第4 位，极显著高于除K4、K6和K7外的培养基；产生的分生孢子量排第5～10 的培养基分别为K3、K25、K27、K21、K5、K17，分生孢子量分别为2.06×105、1.22×105、1.16×105、0.37×105、0.36×105、0.45×105个/皿，其间存在显著性差异；K24、K26和K28培养基产孢量排第11～13位，3个处理间没有显著性差异；K10、K11、K12、K13、K14、K18、K19、K29、K30和K33（CK）10个处理培养基没有产生分生孢子（表3）。

表3 不同合成培养基对病原菌产孢量的影响

因此，K4（燕麦培养基粉7.5 g+煮枝液100 mL+甘露醇2.5 g）培养基为百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）分生孢子产生的最佳合成培养基，其次为K6（燕麦培养基粉7.3 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg+甘露醇2.5g）和K7（燕麦培养基粉7.5 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg、维生素B21.5 mg、维生素B60.2 mg、维生素C 100 mg）培养基，再次为K20（白琼脂粉2.0 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）培养基。

在12种合成培养基上均可产生分生孢子，培养20 d后，孢子成熟率在3.33%～50.00%。

2.2 不同温度对病原菌产孢量的影响

培养温度对百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）载孢体和分生孢子产生的影响较大，温度过低或过高都不利于载孢体和分生孢子产生。由图2 可知，病原菌在K20号培养基上、温度为15～30 ℃产生载孢体，温度≤15 ℃或≥35 ℃时，未产生载孢体。K20和K25培养基在不同温度条件下培养10 d，25 ℃条件下产孢量极显著高于其他处理，20 ℃条件下产孢量其次，30 ℃条件下产孢量较少，温度≤15 ℃或≥35 ℃时，未产生分生孢子。K20和K25培养基在不同温度条件下培养18 d，25 ℃条件下产孢量极显著高于其他，20、30 ℃条件下产孢量其次，15 ℃条件下产孢量较少，温度≤10 ℃或≥35 ℃时，未产生分生孢子，培养18 d 产生的分生孢子量高于培养10 d产生的分生孢子量（图3）。

图2 病原菌在K20号培养基上不同温度条件下生长7 d的状态

图3 不同温度对病原菌产孢量的影响

因此，百香果可可毛色二孢茎基腐病菌分生孢子产生的最适宜的温度条件为25 ℃。

2.3 不同pH值对病原菌产孢量的影响

由图4 可知，百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）在pH 3～6 培养基上产生的载孢体较多，在pH 7～12培养基上产生的载孢体较少。由图5 可知，在pH 为4 时产生的分生孢子量最多，为5.41×105个/皿，极显著高于其他pH 条件；pH 为3 时产生的分生孢子量次之，为4.31×105个/皿，极显著高于除pH 为4 以外的pH 条件；产生的分生孢子量排在第3、4、5位的pH值为5～7，产生的分生孢子量分别为3.13×105、2.67×105、0.78×105个/皿，分生孢子产孢量与pH 值呈反比，pH 越高，产孢量越少，处理间存在显著性差异；pH 为8～12 条件下分生孢子产孢量最少，为0.05×105～0.01×105个/皿，处理间没有显著性差异。

图4 病原菌在不同pH值条件下生长7 d的状态

图5 不同pH值对病原菌产孢量的影响

因此，偏酸性条件有利于百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）分生孢子产生，最适宜pH值条件是pH 4。

2.4 不同光照条件对病原菌产孢量的影响

由图6、图7 可知，光照条件对百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）产生分生孢子的影响较大，在K20和K25培养基上全黑暗光照条件下未产生载孢体，在半光半暗和全光照条件下产生载孢体；K20和K25培养基在半光半暗条件产生的分生孢子量极显著大于全光照和全黑暗，全黑暗条件下产孢量为0。

图6 病原菌在不同光照条件下生长7 d的状态

图7 不同光照条件对病原菌产孢量的影响

因此，可知半光半暗是百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）分生孢子产生的最佳光照条件，全光照次之，全黑暗没有产生分生孢子。

2.5 不同植物枝条培养基对病原菌产孢量的影响

由图8、图9 可知，百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）在15种不同植物组织培养基上培养7 d 后均产生载孢体。其中，在柑橘+PCA 的T4培养基产孢量最多，为19.93×104个/cm2，产生的分生孢子量极显著高于其他培养基；在桑树、扶桑+PCA的T2、T3培养基上，产生的分生孢子量次之，分别为18.13×104、16.72×104个/cm2，极显著高于除T4外的培养基；坚果、百香果、桂花树+PCA的T11、T14、T15培养基产生的分生孢子量排第3 位，为14.40×104、14.14×104、13.86×104个/cm2，极显著高于除T4、T2和T3外的培养基；桑树、李树、龙眼、木瓜、葡萄、阳桃、杧果、黄素梅+PCA 的T2、T9、T13、T6、T15、T8、T7、T12培养基孢子量较少、依次降低。

图8 病原菌在不同植物枝条培养基上生长7 d的状态

图9 不同植物枝条培养基对病原菌产孢量的影响

因此，可知病原菌在15种不同植物枝条培养基上培养均产生分生孢子，柑橘、桑树、扶桑、坚果、百香果、桂花树依次为较适合百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）产孢的植物枝条。

3 讨论

方中达［21］认为，在促进植物病原真菌产孢的研究进程中，培养基与孢子产生关系最大，采用不同培养基或改变它们成分，是促进孢子产生的最主要途径。本次研究结果显示，培养基营养成分对百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）分生孢子产生影响较大，参试的32 个配方培养基中，21 个配方培养基产生分生孢子，11个配方培养基未产生分生孢子。在植物组织培养基上容易产生分生孢子，以OA、CPA+枝条组织培养基产孢量较高，WA、Czapek+枝条组织培养基产孢量次之，CMA+枝条组织培养基产孢量较少或没有产孢，在一定面积的合适基础培养基上，载孢体数量与组织材料面积呈正相关，而分生孢子量与载孢体数量、体积也呈正相关；病原菌在不同合成培养基上产生分生孢子情况差异较大，最佳合成培养基是K4（燕麦培养基粉7.3 g+煮枝液100 mL+甘露醇2.5 g）培养基，其次为K6（燕麦培养基粉7.3 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）和K7（燕麦培养基粉7.3 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg、维生素B21.5 mg、维生素B60.2 mg、维生素C 100.0 mg）培养基，再次为K20（白琼脂粉2.0 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）培养基，其中K4、K6、K7为同一系列营养的培养基，都是以“燕麦培养基粉7.5 g+煮枝液”添加不同微量元素组成，K4和K20培养基添加的微量元素为甘露醇，可知燕麦培养基粉、煮枝液、甘露醇成分可促进载孢体及分生孢子快速产生。在10 种植物组织培养基上培养20 d 后，K9（CMA+碎粒）产生的分生孢子成熟率为90.91%，其他处理孢子成熟率在1.11%～29.41%，在可产生分生孢子的12 种合成培养基培养20 d 后，孢子成熟率在3.33%～50.00%。

本次研究结果表明，培养温度对百香果可可毛色二孢茎基腐病菌分生孢子产生的影响较大，温度过低或过高都不利于分生孢子产生。培养10 d时，只有在20～30 ℃条件下产生孢子，25 ℃产孢量最高，≤10 ℃或≥35 ℃时，没有产生分生孢子；培养18 d时，在15～30 ℃条件下产生孢子，25 ℃产孢量最高，≤10 ℃或≥35 ℃时，没有产生分生孢子，培养18 d产生的分生孢子量高于培养10 d 产生的分生孢子量。因此，百香果可可毛色二孢茎基腐病菌分生孢子产生的最适宜培养温度条件为25 ℃。pH 值对病原菌产孢量的影响较大，史国英等[13]研究结果表明，可可毛色二孢菌在pH 3～4的PSB培养基上培养30 d后可产生子座及分生孢子，在其他pH值条件下没有产生子座及分生孢子。本研究结果表明，百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）在K20（白琼脂粉2 g+煮枝液100 mL+维生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）培养基上培养10 d，pH 3～7均可产生分生孢子及载孢体，pH 4产孢量最多，其次为pH 3，偏酸性条件有利于分生孢子产生。光照条件对可可毛色二孢菌（L. theobromae）产孢量的影响较大，薛振南等[10]研究病原菌在连续光照和12 h 光暗交替处理下产孢结果，认为在连续光照的OMA 培养基上病原菌产孢较快较多；杨德洁等[15]]和谢红辉等[22]研究病原菌在全黑暗及全光照条件下培养产孢情况，认为病原菌在黑暗条件培养处理没有子实体，持续光照有利于分生孢子器的形成和分生孢子的产生。本研究结果认为百香果可可毛色二孢茎基腐病菌（L. theobromae）在全黑暗条件下未形成载孢体及产生分生孢子，在半光半暗条件下产孢量最多，全光照条件下产孢量次之，本研究结果与杨德洁等[15]和谢红辉等[22]研究结果一致，与薛振南等[10]有些不同，可能与所研究的光照强度、病原菌寄主不同有关，可继续在光照强度、光暗间隔时间等方面进一步研究。病原菌在随机挑选的15 种不同植物枝条培养基上培养均形成载孢体及产生分生孢子，柑橘、桑树、扶桑、坚果、百香果和桂花树依次是较适合百香果可可毛色二孢茎基腐病菌产孢的植物枝条，本研究结果再次证明可可毛色二孢菌浸染寄主范围广泛。

4 结论

百香果可可毛色二孢茎基腐病菌在OA、CPA+枝条组织的培养基上培养产孢量较高，最佳合成培养基为配方燕麦培养基粉7.3 g+煮枝液100 mL+甘露醇2.5 g的K4培养基，最佳培养温度条件为25 ℃，最适pH为4，最佳光照条件为半光半暗，柑橘、桑树、扶桑、坚果、百香果和桂花树依次是较适合病原菌产孢的植物枝条。