肝内胆管结石的细菌学病因研究进展

徐西壮，夏晓华，刘瑞文

昆山市第一人民医院，江苏 苏州 215300

原发性肝内胆管结石（primary intrahepatic lithiasis，PIL）在我国的发病率高达1.16%[1]。西方国家90%～95%的胆结石形成于胆囊，PIL占比较少，我国约25%的结石位于肝胆管内[2-3]。PIL主要成分为胆红素钙，属于棕色色素型结石，因其疾病特点复杂多样，治疗困难，复发率高，部分患者常需要反复多次的手术，因而带来巨大的经济及心理负担。PIL的形成是一个复杂且连续的过程，包括胆道的感染、慢性胆管炎、胆道狭窄、结石形成[4]。细菌在PIL的形成及复发中起着重要作用，从细菌学的角度来探讨PIL形成的病因及发病机制，可丰富临床的治疗方法，对临床的PIL防治具有指导意义。目前关于PIL的病因学研究较多，本文结合国内外最新研究文献对PIL形成的细菌学机理进行综述。

1 PIL的菌群失衡

1.1 PIL的细菌种类

过去数十年以来人们对于胃肠道内的微生物进行了广泛研究，但对健康肝脏及胆管的人类胆汁微生物群的相关研究较少。Jiménez等[5]通过对健康猪的胆道菌群进行特征分析发现，健康母猪胆汁及胆道组织可检出微生物群落，其中放线菌门（Actinobacteria）（32%）、变形菌门（Proteobacteria）（32%）、厚壁菌门（Phylum firmicutes）（34%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（2%）占比较高。这一发现打破了人们对于胆汁内无菌的固有认识。目前多种微生物在PIL患者的胆汁、结石、胆道组织中均有不同程度的检出，它们以某种机制促进PIL的形成。有研究在PIL患者及动物模型的实验中均检测到幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）的存在[6-7]，且单纯或同时感染至少一种尿素酶阳性的H.pylori，这是导致胆固醇性结石形成的必要条件；而且，感染细菌种类越多，结石患病率越高。Xiao等[8]通过对40例PIL患者与10例对照者的胆汁样本研究发现，PIL患者菌群多样性较高，其中肠球菌（Enterococcus）（33.77%）与肠杆菌（Enterobacteriaceae）（12.65%）占比较多。Sheen-Chen等[9]等针对150例PIL患者的胆汁进行化验，结果显示需氧菌占比约90%，远高于厌氧菌，革兰氏阴性菌检出较多，为革兰氏阳性菌的两倍。2022年，黄超伟等[10]通过对428例PIL患者的胆汁分析，同样发现革兰氏阴性菌较多，其中主要为大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）（32.92%）和克雷伯氏菌（Klebsiella）（15.66%），革兰氏阳性菌的主要为肠球菌（28.83%）。更有许多国内外研究同样发现，除上述细菌外，铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、摩根氏菌（Morganella morganii）、弗氏柠檬酸杆菌属（Citrobacter freundii）等均有不同程度的检出[11-14]。现将国内外报道的细菌检出情况汇总，见表1。

表1 国内外报道的PIL细菌检出情况汇总

1.2 PIL的细菌检测方法

传统的细菌检测方法多以细菌培养为主，该方法比较耗时且受外部环境影响较大。目前细菌检测逐渐采用最新组学技术结合计算机的深度分析，通过提取整个细菌样本中的DNA，以宏基因组二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）检测微生物的遗传物质[15]。NGS作为一种高通量测序方法可以进行染色体计数并对基因表达谱进行分析[16]。利用NGS技术进行测序研究细菌菌落的结构和组成逐步成为重要检测方式，16S rRNA及16S rDNA基因测序即采用了此技术[17]。16S rRNA基因长度相对较短（约1 542 bp），结构稳定，在大样本量下也容易进行测序，是目前进行微生物鉴定的首选方法，提高了研究效率，也极大地促进了PIL的细菌学研究[18]。

2 PIL形成的细菌学病因

2.1 细菌在胆管内的定植与致石

E.coli等细菌之所以能在胆管内定植，很大程度上依赖自身存在的胆汁酸（bile acids，BAs）耐受性[19-20]，这种耐受性可以保护细菌的细胞质和DNA可以免受BAs的破坏。不同细菌在胆管内的定植可能导致胆固醇的过饱和，使“胆盐-磷脂-胆固醇”平衡被打破，促进PIL的形成。Molinero等[21]研究发现，BAs的耐受性是此类细菌生存的必备能力，这种耐受性的产生依赖于微生物自身的胆汁流出系统和胆汁酸盐水解酶（bile-salt hydrolases，BSHs）的作用。胆汁流出系统通过外排泵将累积在细胞质中的BAs和胆盐挤压至体外；BSHs可自由出入细胞，属弱酸性，可以通过催化某种反应，捕获并运输质子，调节胆汁环境的pH值，维持细胞内环境稳定。

正常胆管内的定植菌数量极其有限，未达到致病条件，这是由于胆汁的冲刷、肝细胞之间的紧密连接、胆盐对细菌增殖的抑制，以及Oddi括约肌的屏障作用[22]。当这些自身保护机制被破坏时，细菌即会通过各种途径进入胆道，使胆道内的微环境发生改变[23]，比如，十二指肠内细菌经乳头反流至胆总管，肠道内细菌经门静脉系统进入肝内胆管，感染的胆囊将细菌输送至胆总管，细菌经周围淋巴系统侵入肝脏。这些因素进一步导致胆管菌群失衡，使胆管内细菌快速生长繁殖，引起胆道急性或慢性炎症，出现胆管壁变性、渗出、增生、炎细胞浸润等改变，甚至还可以引起胆管组织纤维化、胆管重塑、狭窄、变形，这些改变进一步加重了胆汁的排泄负担，出现胆汁淤积，最终导致PIL的形成。

2.2 β-葡萄糖醛酸酶的作用

有研究表明，胆管细菌感染在PIL形成过程中起着重要作用[24]。在胆色素性结石患者的胆汁中发现存在产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，β-G）、胆汁酸水解酶及磷脂酶的细菌。此类细菌多带负电荷，易与带正电荷的钙离子吸附，并在胆道内形成棕榈酸钙。这些细菌所产生的β-G等酶会改变胆汁的理化特性，进一步促进胆色素性结石的生成[25]。此外，低蛋白饮食可导致β-G的抑制剂葡聚糖-1，4内脂水平降低，引起β-G水平变化，同样会导致PIL形成。

革兰氏阴性菌分泌的内毒素，又称脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），在PIL的形成及复发中起着重要作用[26]。这些细菌通过toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）的作用，利用LPS诱导释放多种促炎症及纤维化因子，包括COX-2、MCP-1、IL-6、VEGF、TNF-a、TGF-β1，通过PKC/NF-κ/C-myc途径诱导内源性β-G的增加，导致PIL的形成及复发[27]。革兰氏阴性菌尤其是E.coli通过分泌外源性的β-G刺激胆管分泌内源性β-G，而β-G又可催化胆红素钙的形成，最终导致PIL[4]。有研究表明，细菌感染和胆管梗阻也是内源性β-G活性增高的重要因素，当感染胆汁排空时，外源性β-G迅速下降，而内源性β-G可维持较高水平[28]。这种高水平的内源性β-G在色素性结石的形成中起着重要作用。

2.3 肠道细菌紊乱对胆汁成分的影响

Pedersen等[29]研究发现，高脂饮食可能促进厚壁菌门与拟杆菌门在肠管内的生长，然后进一步通过某种途径进入胆道。针对入侵胆道的肠道细菌，胆汁具有一定的抗菌特性，这种特性主要依赖于BAs发挥作用。BAs具有两亲性，通过结合和溶解膜脂以裂解细菌[30]。BAs进入细菌细胞质后促进并引发细胞毒性机制，使细胞内部酸化，再由牛磺酸结合的胆盐裂解产生有毒化合物如硫化氢，进一步造成DNA损伤。初级BAs比次级BAs毒性更大，而部分肠道细菌可以使初级BAs向次级BAs转化，表达BSHs和胆汁酸诱导（bile acid-inducible，BAI）酶，可修饰并影响BAs的功能及信号特性，使其免受胆汁的溶解[22]。BAs又是法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）的内源性配体，FXR可通过调控相关的细胞因子及受体参与BAs的代谢[31]。肝内BAs升高时，BAs可激活BAs-FXR-小异源二聚体伴侣信号通路，抑制CYP7A1及CYP7B1基因的表达，从而降低BAs在肝内的合成。当出现肠道菌群紊乱，BSH活性增强，促进FXR合成，使得BAs的合成减少、胆固醇的过饱和，这一系列反应打破了“胆盐-磷脂-胆固醇”的平衡性，导致结石的形成。另有研究发现，由肠道细菌代谢产生的氧化三甲胺（trimethylamine-N-oxide，TMAO）是三甲胺（trimethylamine，TMA）的代谢产物，并经肠上皮细胞吸收入血，随后被黄素单加氧酶（flavin containing monooxygenases，FMOs）在肝脏氧化，血浆内高水平TMAO与PIL的形成呈现正相关性[32]。

3 PIL的分子生物学机制

3.1 细胞因子

胆管细胞是一种上皮细胞，主要排列在肝内和肝外的胆管树，其主要的功能是通过多种信号通路控制胆汁的分泌。当出现细菌感染时，胆管细胞发生凋亡、溶解、修复和增殖等病理改变。Cheung等[33]研究发现，当感染导致胆管壁损伤时，正常的胆管分泌功能细胞可被激活，激活后的胆管细胞可增强分泌炎细胞因子和生长因子（包括IL-6、IL-8、TNF-α、血小板源性生长因子、内皮素-1、TGF-β和一氧化氮等）。这些因子而聚集免疫细胞和间充质细胞，增强局部损伤，促进胆道重塑[34]。损伤后的胆管细胞凋亡后开始激活增殖，如果细胞持续损伤，胆管细胞便会处于永久性的细胞周期阻滞和抗凋亡状态，最终导致胆管细胞组织功能障碍，进一步促使胆管壁狭窄变性，胆汁淤积[35]。而胆汁淤积是PIL形成的重要因素[36]，过多BAs的聚集引起胆管壁损伤，再次导致胆管细胞大量分泌细胞因子，形成恶性循环。

3.2 基因与编码蛋白

目前研究较多的致石基因包括CFTR、ABCB4、ABCB11等，它们均以某种机制促进胆汁成分改变和胆道纤维化，促使PIL的形成，而细菌又在某些过程中起着重要作用。在胆管上皮细胞膜表面存在着多种特异性表达分布的转运体和调控蛋白，共同参与并促进肝细胞的胆汁排泄。其中囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）蛋白的异常，可以使胆汁黏稠度增加，导致胆汁淤积[37]。梅璇等[38]通过对104 例PIL患者与同期120 例健康者的CFTR基因测序发现，两组M470V位点上的等位基因存在差异（χ2=15.139，P＜0.01），且M470V位点上等位基因G频率明显高于对照组（60.10%vs41.67%，P＜0.01）。Reichert等[39]通过小鼠实验，重复回交将抗纤维化的FVB/NJ菌株的ABCB4基因片段敲除转移到易纤维化BALB/cJ菌株，然后将这两个同源的敲除菌株杂交，产生的F2后代都是ABCB4基因缺陷的；在16周龄时，F2小鼠均出现不同程度的胆道纤维化。Lammert等[40]同样研究发现，敲除ABCB4基因的小鼠胆汁与胆固醇过饱和，最终导致PIL的形成。Gan等[41]通过外显子测序方法对443例PIL患者和560例健康对照者进行研究，发现ABCB11基因突变，可通过外显子跳跃改变基因剪接，从而影响成熟mRNA表达；而且，突变体中BSEP蛋白的转运功能下降，导致BSEP胆汁转运减少，进而影响胆汁成分，导致PIL。

4 小结与展望

综上所述，PIL的形成是一个复杂且连续的过程，不同菌群通过影响某一个或多个环节，参与PIL的形成。PIL的形成一般伴有胆汁成分改变和胆管的慢性纤维化改变，这使PIL的治疗难度进一步增大。通过研究PIL形成的相关细菌学原理，有助于指导临床上PIL的预防及治疗。目前来看PIL的治疗不单是去除结石，外科手术后防治感染并且维持胆管、肠道内菌群的稳定也是至关重要。此外，关于国内外PIL的细菌学病因的研究成果较多，但具体机制尚未达成共识，利用这些成果在临床上对应的治疗方法尚处于探索阶段，还需进行更高质量的随机对照研究，为PIL的防治提供新的理论依据。