小儿咳喘灵颗粒HPLC 指纹图谱的建立及化学模式识别研究

胡凤，黄魏，赵中开，钟云

自贡检验检测院，四川 自贡 643000

小儿咳喘灵颗粒由麻黄、苦杏仁、甘草、石膏、金银花、板蓝根、瓜蒌组成，在临床上可以用于儿童的咳嗽、呼吸道感染、气管炎等，属于儿科用药且用药广泛［1-4］。小儿咳喘灵颗粒质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》（中药成方制剂标准第四册），标准编号为WS3-B-0688-91［5］。虽然有部分企业使用局颁标准，检验项目略有增加，但绝大多数的小儿咳喘灵颗粒现执行标准仍为WS3-B-0688-91，该质量标准仅收录了2 个理化鉴别，不能全面控制该制剂质量。现有对小儿咳喘灵颗粒进行含量测定的研究［6-8］总共涉及到13 个指标成分，以金银花和麻黄类的含量测定研究居多。

指纹图谱可有效控制中药及中药制剂的质量。由于中药化学成分复杂，指纹图谱既能够体现中药化学组分的整体水平，又可以较全面地反映中药所含化学成分的种类及数量，可以体现中药制剂中化学成分和相对含量［9-13］。中药制剂为多种中药饮片制备而成，其化学成分相对于化学药而言十分复杂，高效液相色谱（HPLC）能够很好将中药制剂中的多个组分进行分离，指纹图谱能较为全面地呈现出相同品种中药制剂中化学组分数量与分布规则，可以反映中药制剂的整体特征［14-17］。

本研究采用HPLC 法分析小儿咳喘灵颗粒中的相关化学成分，建立其指纹图谱，寻找各药材的特征成分，并结合聚类分析、主成分分析（PCA）2 种化学模式识别方法，对小儿咳喘灵颗粒质量进行评价，以期为小儿咳喘灵颗粒质量的药品监管提供技术支撑［18］。

1 仪器与试验材料

1.1 仪器

赛默飞U3000 高效液相色谱仪，XSE-205 梅特勒电子天平，UPR-Ⅱ-20L 纯水仪，SCQ 超声波清洗器。

1.2 试剂与试药

甘草酸铵对照品、盐酸麻黄碱对照品、甘草苷对照品、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品、R,S-告依春对照品、绿原酸对照品、木犀草苷对照品、苦杏仁苷对照品、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品，均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110731-202021、171242-201809、111610-201908、111894-202104、110753-202018、110753-202018、111720-201609、1110820-201808、111782-201807，含量分别以96.2%、100.0%、95.0%、95.1%、96.1%、96.1%、94.9%、98.2%、94.3%计。

乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为超纯水（由UPR-Ⅱ-20L 纯水仪制备）。收集小儿咳喘灵颗粒10 批，均为市售品种，分别来自10 个不同生产厂家，编号S1 到S10，具体信息见表1。

表1 小儿咳喘灵颗粒生产厂家信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为WelchXtimate C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），梯度洗脱，以乙腈（B），0.1%磷酸溶液（A）为流动相，洗脱条件：3%B →15%B（0～20 min），15%B →20%B（20～35 min），20%B →30%B（35～45 min），30%B →60%B（45～60 min），60%B（60～65 min）；流速为1.0 mL/min；进样体积为10 μL；色谱柱柱温为30 ℃；DAD 检测器，光谱范围190 nm～400 nm，检测波长为210 nm。

2.2 溶液的制备［13-14］

2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称定R,S-告依春14.3 mg 置25 mL 量瓶中、苦杏仁苷19.1 mg 置10 mL 量瓶中、盐酸麻黄碱30.8 mg 置25 mL 量瓶中、绿原酸22.3 mg 置50 mL 量瓶中、甘草苷19.4 mg 置50 mL 量瓶中、木犀草苷18.1 mg 置25 mL 量瓶中、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸19.1 mg 置25 mL 量瓶中、甘草酸铵20.7 mg 置50 mL 量瓶中、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸22.9 mg 置25 mL 量瓶中，加适量甲醇超声溶解后再加甲醇至刻度，摇匀；分别精密量取上述标准储备溶液1 mL 置同一10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备取小儿咳喘灵颗粒适量，混匀，研细，取约1 g，精密称定，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷至室温，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用微孔滤膜过滤，即得。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验精密称取小儿咳喘灵颗粒（编号S1）1 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6 次，计算小儿咳喘灵颗粒样品指纹图谱中9 个已知共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD（以绿原酸为参照峰）。结果9 个已知共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，表明高效液相色谱仪的精密度良好。

2.3.2 重复性试验精密称取同一批次的小儿咳喘灵颗粒（编号S1）6 份，按照“2.2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，进行测定，计算小儿咳喘灵颗粒样品指纹图谱中9 个已知共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD（以绿原酸为参照峰）。结果9 个已知共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3 %，表明本方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验精密称取小儿咳喘灵颗粒（编号S1）1 份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在室温环境下，分别在0、6、12、24、48 h 注入高效液相色谱仪中，进行测定，计算小儿咳喘灵颗粒样品指纹图谱中9 个已知共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD（以绿原酸为参照峰）。结果9 个已知共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，表明供试品溶液在48 h 内稳定。

2.4 小儿咳喘灵颗粒HPLC 指纹图谱的建立及相似度评价

2.4.1 指纹图谱的建立取收集的10 批小儿咳喘灵颗粒样品（S1～S10），按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。将得到的10 批小儿咳喘灵颗粒HPLC 色谱图数据以cdf 文件的格式导出，再将所导出的cdf 文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A 版）进行分析，以S1 的色谱图作为参照图谱，时间窗宽设定0.1 min，经多点校正后生成10 批样品色谱图的叠加指纹图谱，并采用中位数法生成对照指纹图谱R［19-22］，结果见图1。

图1 小儿咳喘灵颗粒HPLC指纹图谱及对照指纹图谱

2.4.2 共有峰的指认上述10 批样品的指纹图谱中，以绿原酸为参照物峰，共有16 个保留时间相对稳定的共有峰，结合对照品的保留时间及光谱图，共确认了9 个已知共有峰，分别为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、R,S-告依春、绿原酸、甘草苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸和甘草酸铵，见图2。

图2 小儿咳喘灵颗粒色谱图：A.对照品溶液；B.供试品溶液

2.4.3 相似度评价10 批小儿咳喘灵颗粒样品与对照图谱的相似度均在0.901～0.962 之间，说明10 批小儿咳喘灵颗粒的化学组分基本相似，10 家生产厂家的制剂生产工艺基本稳定，所建立的指纹图谱可以用于小儿咳喘灵颗粒的整体质量控制。

2.5 聚类分析

利用SPSS 25.0 软件，将10 批小儿咳喘灵颗粒指纹图谱9 个已知共有峰面积的标准化值作为参量，采用组间联接法，平方欧式距离测量法进行聚类分析，并绘制树状图［23-24］。结果显示，当组间距为10 时，样品可聚为2 类，第一类为1 号样品，其他样品为一类，见图3。中药色谱指纹图谱相似度分析可见10 个不同生产厂家小儿咳喘灵颗粒的指纹图谱相似度较好，而聚类分析却将10 组样品分为2 类，说明这10 批样品的化学成分虽然种类相近，但其具体含量可能存在一定差异。四川A厂为I 类，其余9 个生产厂家为Ⅱ类，I 类相对于Ⅱ类中R，S-告依春、绿原酸、甘草苷、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸及4,5-O-二咖啡酰奎宁酸的相对峰面积较大，对聚类分析结果的影响较大。

图3 10批小儿咳喘灵颗粒聚类分析结果

2.6 主成分分析

以9 个已知共有峰面积作为变量，利用SPSS 25.0 软件对10 批小儿咳喘灵颗粒的各峰面积进行主成分分析，得到相关矩阵的特征值与方差贡献率、因子载荷矩阵，结果见表2，表3。以主成分的特征值大于1 为标准，分析各成分方差贡献率发现，主成分1，主成分2 的贡献率较大，分别为64.379%，15.342%。前2 个主成分累计方差贡献率为79.722%，能较好地涵盖9 个已知共有峰的信息，具有代表性，故选取前2 个成分为主成分进行分析评价［25］。

表2 小儿咳喘灵颗粒共有峰特征值与方差贡献率

表3 小儿咳喘灵颗粒因子载荷矩阵

结合表2，计算得到9 个已知共有峰的权重系数，推出各主成分方程式，再将标准化后的10 批小儿咳喘灵颗粒已知组分的峰面积数据代入方程式中，分别得到10 批次小儿咳喘灵颗粒的主成分得分。结合各主成分方差贡献率综合评价各批次小儿咳喘灵颗粒样品（综合得分=0.643 79×Y1+0.153 42×Y2，其中Y1、Y2 分别为各样品第一主成分、第二主成分得分），并根据得分对10 家不同生产企业的小儿咳喘灵颗粒进行排名，结果见表4。

表4 小儿咳喘灵颗粒因子得分和综合排名

再利用SIMCA 14.1 软件对10 批小儿咳喘灵颗粒的各峰面积进行主成分分析数据，以2 个主成分建立坐标系，得到10 批小儿咳喘灵颗粒PCA 分析图，见图4。由PCA 分析图可见，小儿咳喘灵颗粒明显分布于2 个区域，可以被分为2 类，1 号为一类，其余为另一类，与SPSS 25.0 软件的主成分分析排名及聚类分析结果一致。

图4 小儿咳喘灵颗粒主成分分析图

3 结果与讨论

3.1 供试品提取条件的优化

本试验分别对小儿咳喘灵颗粒用不同提取溶剂（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇），不同提取时间（15、30、45、60 min），不同提取方式（加热回流、超声）进行了比较。结果表明采用70%甲醇为提取溶剂的超声提取方法简单，能体现多个组分，且提取效率较高。

3.2 检测波长的选择

设定在190 nm～400 nm 全波长下扫描小儿咳喘灵颗粒样品，对色谱峰的全面性、基线平稳性、各峰分离度等方面进行分析，结果表明210 nm 波长下峰形良好，色谱峰较多，峰面积数值合适，所以选择210 nm 波长为测定波长。

3.3 流动相的选择

比较了不同的流动相系统，分别为甲醇-水、乙腈-水，发现甲醇-水系统的分离度较差；乙腈-水流动相系统分离度较好，但峰型较差，部分组分存在严重拖尾情况。在乙腈-水流动相系统基础上增加磷酸，当流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液时，既可以较好地分离各个组分，又可保持较好的峰形。因此选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，并采用梯度洗脱方式。

3.4 不同色谱柱及高效液相色谱仪之间比较

分别考察了不同色谱柱及不同品牌的高效液相色谱仪对该方法的影响。分别使用了WelchXtimate（4.6 mm×250 mm，5 μm），AgilentTC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm），Grace SmarC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；Agilent1260 高效液相色谱仪、赛默飞U3000 高效液相色谱仪。不同品牌、不同型号的色谱柱及不同品牌高效液相色谱仪对各峰的保留时间和峰面积有一定影响，但对指纹图谱的整体影响均很小。

3.5 指纹图谱评价

主成分分析对高维数据进行降维，将多个变量的原始数据变换为几个主成分，这些主成分可以反映原始数据的绝大部分信息［26-27］。本研究借助相似度评价、聚类分析和主成分分析方法对10 批小儿咳喘灵颗粒的指纹图谱进行评价，均表明10 批小儿咳喘灵颗粒样品可聚为2 类，1 号为一类，其他样品为一类，从得分看1 号生产厂家的综合分数远远高于其他生产厂家，分析可能因为1 号生产厂家采用的药品质量标准为局颁标准，标准内容包含薄层色谱及含量测定等内容，可能在生产过程中对中药材原料的控制较好。其余生产厂家的综合得分较低，这可能是中药材及中药饮片原料质量的不同及小儿咳喘灵颗粒生产过程中的投料规范性等原因导致的。

本研究建立的指纹图谱确定了16 个共有峰，通过与对照品的保留时间及光谱图进行比对，确认了其中绿原酸等9 个化学组分。10 批样品与对照图谱的相似度均在0.901～0.962 之间，再结合化学模式识别分析，可用于分析及评价小儿咳喘灵颗粒的质量，为小儿咳喘灵颗粒质量标准的提升提供参考依据。