连钱草的质量标准提高研究

周雷罡，马银松，喻何云，袁铭铭，吴西

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

连钱草为唇形科植物活血丹Glechoma longituba（Nakai）Kupr 的干燥地上部分。春至秋季采收，除去杂质，晒干。主要产于河南、安徽、江西、江苏等地，具有利湿通淋，清热解毒的功效，临床用于石淋、热淋、疮痈肿痛、湿热黄疸、跌打损伤［1］。现代药理研究证实，连钱草的急性毒性很小，具有利尿利胆、调血脂、溶石、降血糖、抗炎、抗菌、抗癌等作用［2-4］。连钱草的化学成分主要是黄酮类、有机酸类、萜类等化合物［5-9］。

现行质量标准收载于2020 年版《中国药典》一部［1］，建立了木犀草素和连钱草对照药材为指标的薄层鉴别。但木犀草素存在于多种药用植物中，专属性较差，不能全面准确地反映连钱草的内在质量，同时现行标准无含量测定项。同时以连钱草作为君药的中成药排石颗粒在2020 年版《中国药典》一部［1］中新增了以迷迭香酸含量作为连钱草质控指标的含量测定项。迷迭香酸有着广泛的生物学活性，如抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节、抗血栓及对细胞的保护作用［10-11］。同时排石颗粒标准保留了熊果酸的薄层鉴别方法，而作为原药材的连钱草却无含量指标以及熊果酸的薄层鉴别。以上情况表明，现有标准难以有效控制连钱草的质量，影响连钱草及其相关产品临床用药的有效性和安全性，有必要对连钱草的标准进行提高，为此根据2022 年度国家药典委标准提高任务书要求，新增了熊果酸的薄层鉴别和迷迭香酸的含量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦公司Agilent 1260 型高效液相色谱仪；赛多利斯公司Sartorius BT25S 电子天平（十万分之一），Sartorius BSA124S-CW 电子天平（万分之一）。

1.2 试剂和试药

对照药材连钱草（批号121386-201302），对照品熊果酸（批号110742-201823）和迷迭香酸（批号111871-201414，含量98.1%）均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工有限公司生产）；水为娃哈哈饮用纯净水；乙腈为色谱纯。26 批连钱草药材由企业提供及课题组实地采收，详细情况见表1。

表1 26批连钱草详细信息

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

取连钱草粉末0.5 g，加入乙酸乙酯40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取连钱草对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［《中国药典》2020 年版四部（通则0502）］试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各2～5 μL 对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图1。

图1 熊果酸TLC色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取迷迭香酸对照品23.55 mg，置50 mL 量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液1.0 mL，置10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得迷迭香酸对照品溶液（含量为0.046 2 mg/mL）。

2.2.2 供试品溶液制备取连钱草药材粉末（过3 号筛）约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，加热回流45 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件采用资生堂waters SunFire C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，以乙腈-0.1%磷酸溶液（21∶79）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长330 nm，进样量10 μL。在上述色谱条件下，供试品色谱中与对照品对应的吸收峰的理论板数不低于3 000，且空白溶剂无干扰，色谱图见图2。

图2 系统适用性色谱图：A.对照品；B.连钱草药材；C.空白溶剂

2.2.4 线性关系的考察精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别置10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得标准系列对照品溶液。按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，以浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，绘制标准曲线，回归方程为y=0.134x-30.499，r=0.999 9。结果表明迷迭香酸在4.62～231.03 μg/mL 之间呈良好的线性。

2.2.5 精密度试验取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件重复进样测定6 次，测得迷迭香酸峰面积RSD 为0.26%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验取同一份连钱草供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，测得迷迭香酸峰面积RSD 为0.28%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.2.7 重复性试验取同一批连钱草样品（批号220712），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，测得迷迭香酸含量为4.428 mg/g，RSD 为0.48%，表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验取已知含量的同一批连钱草样品（批号220712）6 份，每份约0.25 g,精密称定，精密加入含迷迭香酸对照品（0.023 1 mg/mL）的50%甲醇溶液50 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果回收率良好，结果见表2。

表2 回收率试验结果

2.2.9 色谱柱耐用性考察取同一批连钱草样品（批号220712）约0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别采用waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm,5 μm），InertSustainSwift C18（250 mm×4.6 mm,5 μm），YMC-Pack C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）三种不同的色谱柱进行测定，结果迷迭香酸峰在各色谱柱均分离良好，测得含量无明显差异。

2.2.10 含量测定分别取26 批连钱草样品各0.5 g，每批取3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.3”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，用外标法计算出迷迭香酸的含量，结果含量在0.827～12.484 mg/g 之间，见表3。

表3 样品含量测定结果（n=3） mg/g

3 讨论

3.1 熊果酸的薄层鉴别

本研究建立的连钱草中熊果酸的薄层色谱，方法简便，斑点清晰，分离度好，专属性强。且相对于《中国药典》中相关熊果酸薄层色谱的展开剂三氯甲烷、丙酮、甲苯等，本实验采用的环己烷、乙酸乙酯更为低毒性，更为环保。

3.2 迷迭香酸的含量测定研究

由表3 可知，测得的26 批次连钱草药材迷迭香酸平均含量为5.146 mg/g，限度按平均值的70%计算得3.60 mg/g。通过分析收集到的26 批药材的信息，可以很明显地发现二茬采收的连钱草药材均不合格，头茬药材均符合规定，推测第二次采收时间与第一次采收时间间隔较短，药材二次生长的时间还不够，导致含量较低。

本试验建立连钱草中熊果酸的薄层鉴别和迷迭香酸的含量测定方法，该方法简便、可靠，能有效地提高连钱草的质量控制水平。