微小RNA-27a通过Nrf2对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

徐桂萍 陈哲 王晓丽 古文玉

心肌缺血患者的临床治疗通常首选再灌注治疗，然而缺血心肌再灌注往往会引起由氧化应激、炎症反应等造成的心肌细胞凋亡和坏死，即心肌缺血再灌注损伤（MIRI）[1]，严重影响临床治疗效果及患者预后。

微小RNA（miRNA）是长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，参与转录后基因表达调控。研究表明，miRNA 广泛参与调节与MIRI有关的心脏疾病的分子通路[2-3]，在MIRI 的发生发展过程中起重要作用。miR-27a 在缺血再灌注（I/R）心肌中显著上调[4]。miR-27a 过表达还可导致细胞活力降低、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）分泌增加以及细胞凋亡率增加[5]。目前对miR-27a 调控的下游靶基因研究较少。

核转录因子红系2 相关因子2（Nrf2）为氧化还原感应转录因子，参与细胞防御的调节，介导细胞修复或再生，具有抗炎、抗凋亡的作用[6]。研究表明，Nrf2 在减轻MIRI 中起重要作用[7]，其活性受miRNA 调节[8]。Narasimhan 等[9]研究表明，miR-144、miR-153、miR27a 和miR142-5p 可通过结合 Nrf2 的3'非翻译区（3'-UTR）抑制内源性Nrf2 的mRNA 表达水平，继而影响Nrf2 激活，诱发各种疾病。生物信息学分析软件示miR-27a可特异地与Nrf2 的3'-UTR 结合，本研究探讨miR-27a 通过Nrf2 对大鼠MIRI 的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

AAV9-miR-27a 腺相关病毒购于上海汉恒生物科技有限公司。miR-27a antagomir 购于上海诚鑫生物科技有限公司，大鼠心肌肌钙蛋白T（cTn-T）、CK-MB、LDH 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购于中国Elabscience 公司。谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒购于中国Elabscience 公司。抗Nrf2 抗体购于美国Affinity 公司。

1.2 实验动物及分组

40 只2～3 月龄雄性成年清洁级SD 大鼠购于新疆医科大学动物实验中心，体质量220～280 g，许可证编号：SCXK（新）2018-0003。采用随机数字表法将大鼠分为4 组（每组10 只）：假手术组（Sham组）、I/R 组、AAV9-miR-27a 过表达+心肌缺血再灌注组（AAV 组）、miR-27a antagomir+心肌缺血再灌注组（AG 组）。AAV 组于缺血前14 d，尾静脉单次注射AAV9-miR-27a 腺相关病毒（2×1011v.g./只大鼠），Sham 组、I/R 组、AG 组尾静脉单次注射与腺相关病毒同等容积的生理盐水。AG 组于缺血前3 d，连续尾静脉注射miR-27a antagomir（2～10 mg/kg），Sham 组、I/R 组、AAV 组连续尾静脉注射与miR-27a antagomir 同等容积的生理盐水。

1.3 MIRI动物模型的制备

术前禁食禁水8 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.33 mL/100 g 进行麻醉，左侧胸部脱毛，气管插管后，连接小动物呼吸机维持呼吸。将大鼠仰卧，四肢固定于循环加热手术台上，连接心电图。随后消毒皮肤，在胸骨左侧第3、4 肋间切开皮肤，逐层钝性分离，充分暴露心脏。经心肌表面于心耳下缘1 mm 处用6-0 缝合针结扎左冠状动脉前降支。心电图ST 段抬高提示心肌缺血。缺血30 min 后，松开结扎线，观察到左心室恢复红润，心电图ST 段抬高部分回落，提示再灌注成功，再灌注时间共为120 min。Sham 组穿线后不结扎冠状动脉。

1.4 心肌梗死面积测定

再灌注120 min 后，每组随机取5 只大鼠，立即处死并取出心脏，冲洗后-20 ℃冰箱保存120 min，沿心脏长轴方向将心肌切成厚度约2 mm 的薄片，2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色后，37 ℃避光孵育15 min，中性甲醛固定15 min。染色后，心肌梗死区呈灰白色，缺血区呈红色，非缺血区呈蓝色。采用ImageJ 图像软件分析，心肌梗死面积百分比＝心肌梗死区面积÷缺血区面积×100%[10]。

1.5 血清cTnT、CK-MB和LDH水平测定

再灌注120 min 后，随机取5 只大鼠，经腹主动脉穿刺取血，4 ℃、3 500 转/min 离心15 min，离心半径5 cm，离心后取上清液。采用ELISA 法测定血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平。

1.6 心肌组织GSH、SOD和MDA水平测定

穿刺取血后，取大鼠心肌缺血再灌注组织120 mg，离心后取上清液。采用ELISA 法测定GSH、SOD 和MDA 水平。

1.7 缺血心肌组织miR-27a表达水平测定

穿刺取血后，取大鼠心肌缺血再灌注组织100 mg，加入1 mL Trizol 溶液提取组织中的总RNA。将RNA 逆转录为cDNA，采用实时定量聚合酶链反应法进行扩增，以U6 作为内参。miR-27a 上游引物：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'；下游引物：5'-AGGAACCCCTAGTGATG-3'。扩增反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。使用2-ΔΔCT公式计算miR-27a 的相对表达水平。

1.8 Western blot法测定心肌组织Nrf2的表达

取少量左心室组织，提取总蛋白，进行蛋白浓度测定。取60 μg 总蛋白进行电泳、转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST 封闭2 h。加入抗Nrf2 抗体（1 ∶1 000，美国Affinity 公司），4 ℃孵育过夜。洗涤后加入二抗（稀释1 ∶10 000，美国Santa Cruz 公司），室温孵育2 h。ECL 显影，用ImageJ 软件测定条带灰度值。目的蛋白的相对表达水平为目的蛋白与内参GAPDH 条带灰度值的比值。

1.9 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件和GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较使用单因素方差分析，2 组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠心肌梗死面积及血清cTnT、CK-MB和LDH水平比较

与Sham 组比较，I/R 组心肌梗死面积百分比及血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平均升高（P均＜0.05）；与I/R 组比较，AAV 组心肌梗死面积百分比及血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平均升高（P均＜0.05）；与AAV 组比较，AG 组心肌梗死面积百分比及血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平均降低（P均＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠心肌梗死面积及血清cTn-T、CK-MB和LDH水平比较（n＝5）

2.2 4组心肌组织GSH、SOD和MDA水平比较

与Sham 组比较，I/R 组心肌组织GSH、SOD水平降低，MDA 水平升高（P均＜0.05）；与I/R组比较，AAV 组心肌组织GSH、SOD 水平降低，MDA 水平升高（P均＜0.05）；与AAV 组比较，AG 组心肌组织GSH、SOD 水平升高，MDA 水平降低（P均＜0.05）。见表2。

表2 4组大鼠心肌组织GSH、SOD和MDA水平比较（n＝5）

2.3 4组大鼠心肌组织中miR-27a及Nrf2表达水平比较

与Sham 组（0.70±0.57）比较，I/R 组miR-27a 表达水平（1.28±0.43）升高；与I/R 组比较，AAV 组miR-27a 表达水平（1.57±0.27）升高；与AAV 组比较，AG 组miR-27a 表达水平（1.01±0.37）降低（P均＜0.05）。

与Sham 组比较，I/R 组Nrf2 的蛋白表达水平明显降低；与I/R 组比较，AAV 组Nrf2 的蛋白表达水平明显降低；与AAV 组比，AG 组Nrf2 的蛋白表达水平明显升高（P均＜0.05）。见图1。

图1 4组大鼠心肌组织Nrf2的蛋白表达情况

3 讨论

心肌缺血后，心肌组织血液供应减少或中断，恢复缺血梗死区血供是治疗缺血性心肌病的主要手段。然而心肌血流恢复可能加重心肌细胞的损伤，引起心肌细胞氧化应激加重和细胞凋亡，导致心力衰竭[11]。Liu 等[12]研究发现，在I/R 小鼠的心肌中miR-27a 的表达明显增加，且下调miR-27a抑制了胸段硬膜外高位阻滞对小鼠MIRI 的保护作用。Bao 等[13]的研究表明，miR-27a 通过靶向三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A），调节细胞凋亡诱导因子（AIF）从线粒体到细胞核的转运，从而促进MIRI。Lin 等[14]研究发现，miR-27 和miR-195 在缺氧诱导的心肌细胞中表达上调，可抑制部分转录因子的表达，而抑制miR-27 和miR-195可部分逆转这些转录因子的表达。上述研究均表明，miR-27a 在MIRI 过程中发挥着重要作用。

Liu 等[15]研究发现，当沉默Nrf2基因时，缺氧对miR-27a 的抑制作用被逆转。Wang 等[16]通过小鼠六价铬[Cr(VI)]模型，证实Nrf2是miR-27a/b的直接靶标，抑制miR-27a/b 使小鼠在Cr(VI)暴露的早期和晚期出现Nrf2上调。Teimouri 等[17]研究表明，miR-27a 的过表达可抑制Nrf2及其下游抗氧化基因的表达并增加活性氧的产生，而抑制miR-27a的表达逆转了这些作用。因此，Nrf2可能是miR-27a潜在的下游靶点。

本研究结果表明，MIRI 大鼠心肌组织中miR-27a的表达水平显著增高，通过感染miR-27a 腺相关病毒使miR-27a 过表达，大鼠心肌梗死面积及血清cTn-T、CK-MB 和LDH 水平增加，心肌组织GSH、SOD 水平降低，MDA 水平增加，表明缺血心肌损伤加重，氧化应激水平增强。而抑制miR-27a 的表达则可显著改善心肌损伤及氧化应激水平，提示miR-27a 加重大鼠MIRI。为探究miR-27a 加重大鼠MIRI 的分子机制，即miR-27a 潜在的下游靶点，本研究通过Western blot 检测相关蛋白，发现过表达miR-27a 可抑制Nrf2的表达，这与我们在Targetscan 软件中预测miR-27a 可特异性与Nrf2的3'-UTR 结合、抑制Nrf2表达一致。

以上研究表明，miR-27a 可能通过抑制Nrf2表达，增强心肌细胞氧化应激损伤，从而加重MIRI。