骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-214-3p调控IKBKB基因促进宫颈癌细胞焦亡

黎康玲，张潇迪，刘珏，张志伟

骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-214-3p调控IKBKB基因促进宫颈癌细胞焦亡

黎康玲1，张潇迪1，刘珏1，张志伟2

1.南华大学衡阳医学院附属第二医院妇产科，湖南衡阳 421000；2.南华大学肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室，湖南衡阳 421000

探究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）外泌体源性miR-214-3p调控B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子激酶β（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta，IKBKB）对宫颈癌细胞的影响。采用生物信息学方法分析宫颈癌组织中异常表达的微RNA，最终选择miR-214-3p作为目的基因，并确定其下游靶基因IKBKB；检测宫颈癌患者的癌组织及癌旁组织中miR-214-3p、IKBKB的表达情况；提取并鉴定BMMSC外泌体，干预外泌体中miR-214-3p的表达水平，构建IKBKB过表达质粒，将改造后的外泌体及质粒分别转染至宫颈癌HeLa细胞，测定转染后不同组别宫颈癌细胞焦亡相关指标。生物信息学和实验检测均发现miR-214-3p在宫颈癌组织和细胞中低表达，而在BMMSC外泌体中高表达，且BMMSC源性外泌体可显著提高宫颈癌细胞中miR-214-3p的表达水平；IKBKB基因是miR-214-3p的下游靶点，在宫颈癌组织和细胞中高表达；高表达miR-214-3p可促进宫颈癌细胞焦亡，过表达IKBKB基因后宫颈癌细胞的焦亡水平显著降低。BMMSC分泌的外泌体通过携带miR-214-3p调控IKBKB促进宫颈癌细胞焦亡。

骨髓间充质干细胞；外泌体；miR-214-3p；IKBKB；宫颈癌

宫颈癌是女性癌症死亡的主要原因，近年来发病逐渐年轻化[1-2]。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗及宫颈细胞学早期筛查的推广，使宫颈癌在预防与早期发现方面取得巨大进展[3]。然而仍有部分患者因复发与淋巴结转移导致死亡[4]。分子生物学的发展对探究宫颈癌的发病机制具有重要意义[5]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）是一种多能干细胞，可转移至肿瘤组织内进而影响肿瘤进展[6]。外泌体是指包含多种RNA等生物分子的小膜泡[7]。它被证实可能参与细胞生长分化和肿瘤转移等多种病理生理过程[8]。Huang等[9]研究发现间充质干细胞来源的外泌体可改善原发性卵巢功能不全患者的卵巢功能。miR-214富集BMMSC衍生的外泌体通过靶向Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ调节心脏干细胞的氧化损伤[10]。但目前BMMSC外泌体源性miR-214-3p对宫颈癌的具体作用尚未阐明。本研究旨在深入探讨BMMSC外泌体源性miR-214-3p对宫颈癌发生发展的影响及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年11月至2020年11月于南华大学衡阳医学院附属第二医院接受手术治疗的宫颈癌患者45例，年龄（46.9±12.8）岁。患者均经病理诊断确诊为宫颈癌且术前未接受放化疗或其他全身性治疗，并除外其他系统的恶性肿瘤或合并严重的全身性疾病。本研究经南华大学衡阳医学院附属第二医院伦理委员会批准（伦理审批号：2019k007）。

1.2 细胞及试剂

正常宫颈上皮细胞株HaCaT购自上海艾研生物科技有限公司，宫颈癌细胞株HeLa及BMMSC购自广州赛库生物技术有限公司，Lipofectamine 3000试剂盒、Exo-FectTM外泌体转染试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司，双荧光素酶基因检测试剂盒购自GeneCopoeia公司，荧光素酶报告质粒psiCHECK-2购自美国Promega公司。

1.3 生物信息学分析

在GEO数据库中选择GSE55478数据集进行分析，该数据集包括4例宫颈癌组织及对应的正常子宫颈组织中差异表达的微RNA（microRNA，miRNA）。绘制火山图并选择在宫颈癌中显著下调的前10个miRNA绘制热图。DIANA TOOLS网站对miRNA进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。在TargetScan网站获取miR-214-3p的下游靶基因并借助DAVID网站进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析。DisGeNET网站检索宫颈癌发病风险基因。STRING数据库进行蛋白–蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析。UALCAN网站分析B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子激酶β（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta，IKBKB）的表达水平。

1.4 细胞培养

将正常宫颈上皮细胞株HaCaT与宫颈癌细胞株HeLa在杜尔贝克改良的Eagle’s培养基中培养。待细胞融合度达到80%左右进行后续实验。使用定量反转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术检测HaCaT与HeLa细胞株中miR-214-3p、IKBKB的表达。

1.5 靶向关系验证

TargetScan网站预测miR-214-3p与IKBKB特异性结合位点，将IKBKB中含有miR-214-3p结合位点的3’UTR片段扩增并克隆到荧光素酶报告质粒psiCHECK-2，将该质粒命名为IKBKB-WT。在原有结合位点进行定点突变，形成突变片段，同样扩增并克隆到psiCHECK-2质粒上，将该质粒命名为IKBKB-MUT。将以上两种质粒分别与miR-214-3p NC、miR-214-3p mimic共转染至宫颈癌细胞株HeLa中，转染步骤依据Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行，最后借助双荧光素酶基因检测试剂盒对两组细胞的荧光素酶活性进行检测，并使用海肾荧光素酶活性对结果进行归一处理。

1.6 提取BMMSC及BMMSC源性外泌体

将BMMSC接种于杜尔贝克改良的Eagle’s培养基中，37℃、5% CO2环境中培养。每3天更换一次培养基，选择第5代细胞进行后续实验。通过流式细胞术鉴定BMMSC，再将BMMSC在超速离心后不含外泌体的杜尔贝克改良Eagle’s培养基中培养48h，收集上清液。之后采用差速离心法分离外泌体。4℃下300g离心10min，2000g离心15min，清除细胞碎片，4℃下100 000g离心1h。将沉淀重悬在磷酸盐缓冲液中，4℃下100 000g离心90min，收集沉淀–80℃保存。通过蛋白质印迹法检测外泌体表面标记蛋白CD63、CD9、CD81的表达。

1.7 细胞内化实验

BMMSC在PKH67染色液中悬浮，室温孵育4min。加入0.5%牛血清白蛋白使反应终止。分离BMMSC外泌体，得到PKH67标记的外泌体。将外泌体悬浮并与HeLa细胞在37℃、5% CO2培养箱中共孵育3h。加入DAPI将细胞核染色。在荧光显微镜下观察染色的HeLa细胞。

1.8 细胞转染和分组

本研究分组如下：control组（未经处理的HeLa细胞）、exo组（外泌体与HeLa细胞共培养）、exo-miR-214-3p组（转染miR-214-3p mimic的外泌体与HeLa细胞共培养）、exo-inh-miR-214-3p组（转染miR-214-3p inhibitor的外泌体与HeLa细胞共培养）、exo-miR-214-3p+pcDNA3.1组（转染miR-214-3p mimic的外泌体与转染pcDNA3.1对照的HeLa细胞共培养）、exo-miR-214-3p+pcDNA3.1-IKBKB组（转染miR-214-3p mimic的外泌体与转染过表达IKBKB的HeLa细胞共培养）。依据Lipofectamine 3000试剂盒与Exo-FectTM外泌体转染试剂盒进行转染，48h后进行后续实验。

1.9 细胞焦亡检测

检测转染后各组别中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、胱天蛋白酶-1（caspase-1）、衔接蛋白、消皮素D mRNA的表达水平。将转染后的细胞在37℃、5% CO2的条件下培养，1500转/min离心10min，收集上清液进行酶联免疫吸附测定，检测白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-18分泌水平。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 miR-214-3p在宫颈癌组织中低表达

GSE55478数据集中38个miRNA在宫颈癌中显著上调，53个miRNA显著下调，见图1A。选择在宫颈癌中显著下调的前10个miRNA绘制出热图，见图1B。qRT-PCR检测结果显示，宫颈癌组织中miR-214-3p相对表达显著低于癌旁组织（<0.05），见图1C。BMMSC源性外泌体中miR-214-3p的表达上调（<0.05），见图1D。将PKH67标记的外泌体与HeLa细胞共孵育，外泌体显著提高HeLa细胞中miR-214-3p的表达（<0.05），见图1E。

图1 miR-214-3p在宫颈癌组织中的表达结果

A.GSE55478数据集火山图；B.GSE55478数据集中显著下调的前10个miRNA的热图；C.宫颈癌患者癌组织和癌旁组织中miR-214-3p的表达比较；D.miR-214-3p在外泌体及HeLa细胞中的表达差异；E.外泌体与HeLa细胞共孵育后miR-214-3p的表达检测结果

注：<0.05

2.2 miR-214-3p与IKBKB靶向关系验证

借助TargetScan网站检索与miR-214-3p存在特异性结合位点的基因进行GO功能富集分析并绘制气泡图，见图2A。PPI分析结果显示IKBKB与环氧合酶2（PTGS2）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、周期蛋白依赖激酶抑制因子2A（CDKN2A）等蛋白具有较强的联系，见图2B。双荧光素酶报告实验进一步确定miR-214-3p与IKBKB的靶向关系，见图2C。UALCAN网站显示IKBKB在宫颈癌中表达上调，见图2D。qRT-PCR进行验证，癌组织中的IKBKB呈现高表达（<0.05），见图2E。宫颈癌组织中IKBKB的表达与miR-214-3p呈负相关（<0.05），见图2F。

2.3 BMMSC及BMMSC源性外泌体鉴定结果

蛋白质印迹法检测外泌体标记物CD63、CD9、CD81均呈阳性表达，见图3。

2.4 miR-214-3p调控IKBKB基因促进宫颈癌细胞焦亡

2.4.1 转染后各组细胞的NLRP3、caspase-1、衔接蛋白、消皮素D mRNA表达水平比较 与control组比较，exo-inh-miR-214-3p组的NLRP3、caspase-1、衔接蛋白、消皮素D mRNA表达水平无明显变化（0.05），exo组和exo-miR-214-3p组的NLRP3、caspase-1、衔接蛋白、消皮素D mRNA表达水平显著升高（<0.05）；exo-miR-214-3p+pcDNA3.1-IKBKB组的NLRP3、caspase-1、衔接蛋白、消皮素D mRNA表达水平显著低于exo-miR-214-3p+pcDNA3.1组（<0.05），见图4。

2.4.2 转染后各组细胞的IL-1β、IL-6、IL-18比较 与control组比较，exo-inh-miR-214-3p组的IL-1β、IL-6、IL-18无明显变化（>0.05），exo组和exo-miR-214-3p组的IL-1β、IL-6、IL-18显著升高（<0.05）；exo-miR-214-3p+pcDNA3.1-IKBKB组的IL-1β、IL-6、IL-18显著低于exo-miR-214-3p+ pcDNA3.1组（<0.05），见图5。

图2 IKBKB与miR-214-3p靶向关系验证及其表达水平测定

A.miR-214-3p靶基因的GO分析结果；B.PPI分析结果；C.双荧光素酶报告实验显示miR-214-3p与IKBKB的特异性结合；D.UALCAN网站预测结果图；E.宫颈癌患者癌组织和癌旁组织中IKBKB的表达差异；F.miR-214-3p与IKBKB的相关性分析

注：<0.05

图3 BMMSC及BMMSC源性外泌体鉴定

3 讨论

肿瘤的发生、发展及临床结局受其生物学功能的影响[11]。研究表明，肿瘤的生物学功能与肿瘤微环境密切相关[12]。间充质干细胞是重要的非肿瘤细胞之一，它可通过广泛的信号传导通路，与肿瘤细胞相互作用，参与诱导或抑制肿瘤进展和转移[13]。研究表明，BMMSC具有肿瘤归巢特性，它被认为是选择性输送抗癌药物的理想载体[14]。但目前BMMSC外泌体源性miR-214-3p对宫颈癌的具体作用尚未阐明。

本研究发现，相较于癌旁组织，宫颈癌组织中的miR-214-3p表达下调，结合生物信息学分析推测miR-214-3p在宫颈癌中表达失调可能会促进宫颈癌发展。此外，使用qRT-PCR技术检测BMMSC源性外泌体中miR-214-3p的含量，结果显示外泌体中含有较高水平的miR-214-3p，将外泌体与宫颈癌细胞共转染后宫颈癌细胞中的miR-214-3p表达也显著上调，表明外泌体能为宫颈癌细胞中缺失的miR-214-3p做出贡献。间充质干细胞外泌体miRNA有望成为肿瘤治疗的新靶点。

研究显示circ_0028171可通过miR-218-5p/IKBKB轴促进骨肉瘤组织的恶性行为[15]。IKBKB与宫颈癌发病也存在紧密联系，如IKBKB表达上调可消除miR-429在宫颈癌中发挥的抑癌作用[16]。Tan等[17]研究发现IKBKB在宫颈癌组织中的表达高于癌旁组织。本研究中，双荧光素酶报告实验显示，IKBKB与miR-214-3p存在特异性结合位点，IKBKB为miR-214-3p的靶基因，通过相关性分析发现宫颈癌细胞中IKBKB基因的表达与miR-214-3p呈负相关，且相较于癌旁组织，宫颈癌组织中IKBKB基因呈高表达状态，表明在宫颈癌中miR-214-3p的表达被抑制而IKBKB基因表达上调。既往文献证实NLRP3、caspase-1、衔接蛋白、消皮素D参与经典的细胞焦亡途径，且焦亡过程伴随着大量炎症介质的释放，如IL-1β、IL-6、IL-18等[18-19]。本研究结果显示高表达miR-214-3p的宫颈癌细胞相关炎症介质水平显著升高，且NLRP3、caspase-1等物质的表达水平也较高，而在高表达miR-214-3p的基础上上调IKBKB表达后，宫颈癌细胞中的相关炎症介质水平明显降低，且NLRP3、caspase-1等物质表达水平也大幅度降低，表明miR-214-3p的过表达可促进宫颈癌细胞产生大量炎症介质，且这一过程与经典的细胞焦亡途径相关。

图4 各组细胞的NLRP3、caspase-1、衔接蛋白、消皮素D mRNA表达水平比较

图5 各组细胞的IL-1β、IL-6、IL-18比较

综上所述，BMMSC源性外泌体通过携带miR-214-3p调控IKBKB表达，可促进宫颈癌细胞焦亡。通过干预BMMSC外泌体中miR-214-3p的表达水平可为治疗宫颈癌提供新的思路。

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Bone marrow mesenchymal stem cell exosome-derived miR-214-3p regulates IKBKB gene to promote pyroptosis of cervical cancer cells

LI Kangling, ZHANG Xiaodi, LIU Jue, ZHANG Zhiwei

1.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, Hengyang 421000, Hunan, China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology, University of South China, Hengyang 421000, Hunan, China

To investigate the effects of exosome-derived miR-214-3p regulation of inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta (IKBKB) on cervical cancer cells by bone marrow mesenchymal stem cell (BMMSC).The abnormal expression of microRNAs in cervical cancer tissues was analyzed by bioinformatics method, and miR-214-3p was selected as the target gene and its downstream target gene IKBKB was identified, and the expression of miR-214-3p and IKBKB in cancer tissues and adjacent tissues of cervical cancer patients was detected. BMMSC exosomes were extracted and identified, the expression level of miR-214-3p in the exosomes was interfered, IKBKB overexpression plasmid was constructed, and the modified exosomes and plasmids were transfected into cervical cancer HeLa cells, respectively, and the relevant indicators of pyrodeath of cervical cancer cells in different groups were determined after transfection.Both bioinformatics and experimental detection showed that miR-214-3p was low expressed in cervical cancer tissues and cells, but high expressed in BMMSC exosomes, and BMMSC-derived exosomes could significantly increase the expression level of miR-214-3p in cervical cancer cells. IKBKB gene was the downstream target of miR-214-3p and was highly expressed in cervical cancer tissues and cells. Overexpression of miR-214-3p could promote the pyrodeath of cervical cancer cells, and the pyrodeath level of cervical cancer cells was significantly reduced after overexpression of IKBKB gene.The exosomes secreted by BMMSC regulate IKBKB by carrying miR-214-3p and promote the pyrodeath of cervical cancer cells.

Bone marrow mesenchymal stem cell; Exosome; miR-214-3p; IKBKB; Cervical cancer

R737.3

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.25.012

衡阳市指导性计划项目（202121034447）

刘珏，电子信箱：lj3457@163.com

（2022–11–21）

（2023–08–10）