柞蚕免疫蛹粉、柞蚕抗菌肽对扇贝生长、免疫力的影响

马淑慧,田 斌,孙永欣,李学军,米 锐,温志新,孟 楠,李亚洁,李树英,都兴范

( 1.辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁 大连 116023; 2.大连市现代农业生产发展服务中心,辽宁 大连 116023 )

虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)属软体动物门瓣鳃纲珍珠贝目扇贝科,具有营养丰富、味道鲜美的优点[1]。20世纪80年代初辽宁省海洋水产科学研究院率先引进虾夷扇贝亲贝并进行相关研究,目前主要养殖在辽宁大连,山东青岛、威海等沿海城市,虾夷扇贝在我国的养殖历史已近40年,其养殖规模与产量得到飞速发展[2]。大规模养殖过程中,防止细菌性疾病的暴发对扇贝养殖的管理至关重要。

近年来,抗菌肽因其对病原体的抗病能力而被研究人员广泛关注[3]。自20世纪80年代初首次从人工诱导的天蚕免疫血淋巴中分离出第一种抗菌肽——天蚕素以来[4-5],抗菌肽逐渐成为昆虫免疫学及分子生物学的研究热点[6-9]。抗菌肽是宿主天然防御的重要参与者,属于机体第一道免疫防线,在抵抗外来病原菌及微生物入侵方面发挥关键作用。抗菌肽具有稳定、水溶性好、对高等动物正常细胞几乎无害的特点,是新一代绿色饲料添加剂[10-12]。迄今为止,抗菌肽已被应用于饲喂虾、鱼等水生动物,研究结果均表现出显著的质量增加和免疫促进作用[13-16]。饲喂添加含有抗菌肽的柞蚕免疫活性蛹粉饲料,在仿刺参(Apostichopusjaponicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)和红鳍东方鲀(Takifugurubripes)中已取得较好效果[17-19],但在虾夷扇贝养殖应用上尚未见报道。笔者以柞蚕蛹粉、柞蚕免疫蛹粉和柞蚕抗菌肽作为饲料添加剂饲喂虾夷扇贝,考察虾夷扇贝体质量和免疫指标变化,以期为拓展柞蚕资源高值化利用及开发新型免疫增强剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

微藻饲料购于山东滨州金海岸水产有限责任公司,试验用虾夷扇贝均来自旅顺浮筏养殖。柞蚕蛹粉、柞蚕免疫蛹粉、柞蚕抗菌肽均为实验室自备,粒径48 μm,制备步骤为:在4 ℃条件下、8000 r/min(离心半径20 cm)离心破蛹去壳,冷冻干燥,得到柞蚕蛹粉;在无菌条件下取指数生长期(37 ℃培养18～20 h,次日转管继续培养6～7 h)的益生菌菌液,用生理盐水稀释20倍后注射到柞蚕蛹体内,注射剂量为50 μL/个。注射后的柞蚕蛹置22～24 ℃培养4 d,其血清抗菌活性达到高峰时(平板检测法),4 ℃下,8000 r/min(离心半径20 cm)将蚕蛹离心破碎,再经去壳、收集匀浆液和冷冻干燥,形成柞蚕免疫蛹粉。同条件下注射的柞蚕蛹在抗菌活性高峰时采集蛹血,沸水浴10 min后离心取上清液,冷冻干燥获得柞蚕抗菌肽粉末[20-21]。

1.2 方法

1.2.1 试验饲料的配制

选择初始体质量(54.75±0.07) g的虾夷扇贝进行饲养试验。暂养7 d后,以螺旋藻为基础饲料饲喂虾夷扇贝作为对照组,在基础饲料中分别添加2%质量分数柞蚕蛹粉、2%质量分数柞蚕免疫蛹粉、2%质量分数柞蚕抗菌肽作为试验组。

1.2.2 试验设计及饲养管理

试验共4组,分别于4个玻璃钢水槽(20 m3水体/水槽)底部分布养殖,每组80个虾夷扇贝。每日上午清理残饵和粪便,全部换水后投喂1次,下午投喂1次,日饲喂量8 mg/L,投饵0.5 h后水色变淡且无假粪现象发生。水温17～21 ℃,溶解氧质量浓度8 mg/L,盐度31,全天充气养殖,试验周期为30 d。

1.2.3 样品采集

自每组随机选取6只虾夷扇贝作为测定混合样本,用1 mL一次性注射器心脏取血,4 ℃凝结6 h后,4000 r/min(离心半径 8 cm)、4 ℃离心10 min,吸取上清液获得血清样品,-80 ℃冷冻备用。

1.2.4 血清酶活性测定

溶菌酶、酸性磷酸酶、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

1.2.5 特定生长率

试验结束后,称量各组虾夷扇贝的体质量并记录,计算其特定生长率(RSG):

RSG/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中,mt和m0为虾夷扇贝的终末体质量和初始体质量(g),t为试验时间。

1.2.6 死亡率

在试验过程中,每日记录各组虾夷扇贝的死亡个数,最后统计累计死亡个数。

1.3 数据处理及统计分析

应用SPSS 21.0软件对4组虾夷扇贝的体质量、溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶数据进行单因素方差分析,用邓肯法进行组间多重比较,数值均以平均值±标准差表示,P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 不同添加组虾夷扇贝的生长情况

饲喂不同添加剂对虾夷扇贝生长情况影响见表1。柞蚕抗菌肽组虾夷扇贝体质量最高,其次是对照组和柞蚕免疫蛹粉组,柞蚕蛹粉组最低。统计学分析表明,柞蚕抗菌肽组虾夷扇贝体质量显著高于对照组(P<0.05),并极显著高于柞蚕蛹粉组和柞蚕免疫蛹粉组(P<0.01)。

表1 不同组别虾夷扇贝的生长

2.2 酶活性测定

2.2.1 溶菌酶活性

经过30 d饲养试验,柞蚕抗菌肽处理组和对照组虾夷扇贝血清中溶菌酶活性较其他两组显著升高(P<0.05),柞蚕抗菌肽处理组较对照组也显著升高,而柞蚕蛹粉组和柞蚕免疫蛹粉组活性显著下降(P<0.05)(图1)。

图1 不同试验组虾夷扇贝血清溶菌酶活性Fig.1 The lysozyme activity of Yesso scallop P. yessoensis in different groups

2.2.2 酸性磷酸酶活性

添加不同饲料对虾夷扇贝血清中酸性磷酸酶活性的影响见图2,柞蚕抗菌肽组虾夷扇贝血清中酸性磷酸酶活性较其他各组显著升高(P<0.05),柞蚕免疫蛹粉组和柞蚕蛹粉组酸性磷酸酶活性降低。

图2 不同试验组虾夷扇贝血清酸性磷酸酶活性Fig.2 The acid phosphatase activity of Yesso scallop P. yessoensis in different groups

2.2.3 超氧化物歧化酶活性

经过30 d饲养试验,4组虾夷扇贝血清中超氧化物歧化酶活性均存在显著性差异,其中柞蚕抗菌肽处理组较其他3组显著升高,柞蚕蛹粉组和柞蚕免疫蛹粉组较对照组显著降低(P<0.05)(图3)。

图3 不同试验组虾夷扇贝血清超氧化物歧化酶活性Fig.3 The superoxide dismutase activity of Yesso scallop P. yessoensis in different groups

2.2.4 过氧化氢酶活性

柞蚕抗菌肽处理组虾夷扇贝血清中过氧化氢酶活性较对照组升高,柞蚕蛹粉组和柞蚕免疫蛹粉组较对照组减少,但均差异不显著(P>0.05)(图4)。

图4 不同试验组虾夷扇贝血清过氧化氢酶活性Fig.4 The catalase activity of Yesso scallop P. yessoensis in different groups

2.3 死亡率

经过30 d饲养试验,各组累计死亡数最高的为柞蚕蛹粉组18个,对照组13个,柞蚕免疫蛹粉组12个,柞蚕抗菌肽组最低,为10个。从发病持续时间来看,柞蚕抗菌肽组在试验的第27 d停止死亡。相比之下,柞蚕免疫蛹粉组死亡现象持续到试验第28 d,而柞蚕蛹粉组和对照组死亡现象持续到试验结束,柞蚕抗菌肽组和柞蚕免疫蛹粉组较对照组和蛹粉组死亡率降低,且柞蚕抗菌肽组死亡率最低(图5)。

图5 饲喂不同饲料添加剂后虾夷扇贝累计死亡统计Fig.5 The mortality of Yesso scallop P. yessoensis fed different feed additives

3 讨 论

3.1 饲喂柞蚕免疫蛹粉和柞蚕抗菌肽对虾夷扇贝生长的影响

柞蚕在受到病原微生物、化学物质、物理因子或创伤等刺激后,其体内能合成一系列生物活性物质,包括柞蚕抗菌肽、溶菌酶、凝集素、防御素等[22]。诱导后的柞蚕免疫蛹粉和柞蚕抗菌肽中含有这些生物抗菌成分,本研究团队之前的研究表明,柞蚕免疫蛹粉可提高仿海参、红鳍东方鲀和凡纳滨对虾的体质量及抗病能力。笔者将柞蚕免疫蛹粉应用到虾夷扇贝饲喂上,并首次采用柞蚕抗菌肽饲喂海产品,结果表明,饲喂柞蚕抗菌肽组虾夷扇贝特定生长率显著增加、体质量增加,表明柞蚕抗菌肽提高了虾夷扇贝的抗病力。柞蚕蛹粉组和柞蚕免疫蛹粉组虾夷扇贝特定生长率降低,试验结束后,解剖虾夷扇贝,在这2组虾夷扇贝消化道中发现未消化颗粒状残渣,表明饲喂蛹粉可能引起虾夷扇贝消化功能降低,阻碍肠道对饵料吸收。如果海水中再悬浮颗粒物的浓度过高,扇贝的滤水率和摄食率也会降低,进而影响贝类的生长[23]。

3.2 饲喂柞蚕免疫蛹粉和柞蚕抗菌肽对虾夷扇贝血清非特异性免疫酶活性的影响

扇贝免疫系统属于先天性非特异性免疫防御系统,溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶直接反映了非特异性免疫防御能力,因此经常被用作衡量机体免疫功能的指标[24-27]。本试验中,柞蚕抗菌肽饲喂虾夷扇贝后血清溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性对比其他组显著增高,说明柞蚕抗菌肽可以被血淋巴吸收,从而诱导溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性的增加。进一步说明添加2%柞蚕抗菌肽的螺旋藻可提高虾夷扇贝的免疫力。饲喂4种不同饲料的虾夷扇贝,其过氧化氢酶活性无明显差异,可能与抗菌肽诱导氧自由基产生的机制不同有关,有待于进一步研究细胞吞噬和氧自由基的产生,以确定虾夷扇贝的抗氧化机制。柞蚕蛹粉组和柞蚕免疫蛹粉组溶菌酶、酸性磷酸酶活性有所降低,可能高蛋白饲料抑制了虾夷扇贝消化道的吸收功能,导致虾夷扇贝机体代谢紊乱。

3.3 饲喂柞蚕免疫蛹粉和柞蚕抗菌肽对虾夷扇贝抗病能力的影响

存活率直接反映动物的抗病力,因此养殖试验中通过攻毒试验测试受试动物抗病力较为普遍,但本试验开始时虾夷扇贝就出现发病死亡现象,因此最后采取统计死亡率考察虾夷扇贝抗病力。本试验中,最早出现发病死亡的是柞蚕免疫蛹粉组,紧接着是柞蚕蛹粉组和对照组,各组未出现暴发性死亡,但死亡现象一直持续到养殖结束。发病后,虾夷扇贝外套膜外缘以及外套膜和贝壳表面接触处呈现褐色,外套膜收缩,感染疾病症状类似于脓胞病[28]。柞蚕抗菌肽处理组虾夷扇贝死亡现象程度较低,且发病持续时间最短。这充分表明,虾夷扇贝摄食柞蚕抗菌肽后,抗病力得到显著提高。抗菌肽在动物体内发挥了抗菌作用,可降低其死亡率,这一结果与Mi等[29-30]抗菌肽可抑制细菌增长、提高虾夷扇贝免疫力的研究结果一致。

4 结 论

本试验结果表明,不同添加剂螺旋藻粉投喂虾夷扇贝30 d后,添加2%柞蚕抗菌肽能显著提高虾夷扇贝特定生长率、免疫力和抗病能力,降低死亡率。添加2%柞蚕蛹粉和2%柞蚕免疫蛹粉对虾夷扇贝的增长和免疫力起到阻碍作用。根据试验结果推测,虾夷扇贝质量增加、免疫力和抗病力的提高与添加物质的抗菌能力有关,其抗菌机制有待于进一步研究。本试验结果对于虾夷扇贝种贝室内人工促熟进行营养和免疫强化具有一定借鉴意义。