水温和余氯对拟穴青蟹幼蟹的急性毒性研究

陈 琳,滕爽爽,陆 振,肖国强,蔡景波

( 1. 浙江省海洋水产养殖研究所,浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室,温州市海洋生物遗传育种重点实验室,浙江 温州 325005;2. 浙江海洋大学,浙江 舟山 316022 )

滨海核电厂通常采用海水作为直流冷却水,通常采用定时向循环冷却水中通氯气[1-2]来解决生物阻塞问题。冷却水排入受纳海域,使海洋生物受到2～12 ℃热冲击和余氯的双重胁迫。升温和余氯直接或间接地影响到近海和河口区的水产资源及养殖业[3-4]。三门湾是多种鱼、虾、贝、蟹的天然繁殖场和养殖基地,更有“中国青蟹之乡”的美称,2019年浙江年产青蟹27 595 t,三门湾年产青蟹约占浙江的50%[5]。三门湾核电站一期工程2台核电机组分别于2013、2014年全部建成投入商业运行[6],三门湾核电站运营后,笔者对邻近海域中余氯污染状况进行了调查,结果显示,游离余氯质量浓度为0.01～0.18 mg/L,化合余氯质量浓度为0.01～0.02 mg/L,余氯在海水中形态主要为游离态。

自20世纪60年代以来,国外研究者就对余氯的生态效应开展了大量研究[7-9]。我国自上世纪80年代以来也开展了相关研究[10-12]。Rodrigues Macêdo等[7]研究了次氯酸钙活性氯对三角涡虫(Dugesiajaponica)的生态毒理学效应,指出96 h半致死质量浓度为3.16 mg/L,亚致死毒性表现为进食和运动明显减少,生殖和生育能力受损;李毅等[12]研究了模拟夏季温排水对福宁湾常见海洋生物的热耐受性的影响,指出三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的 24 h高起始致死温度为38.2 ℃;吴杨平等[13]研究了余氯对大竹蛏(Solengrandis)稚贝的毒性及半致死质量浓度,指出三氯异氰尿酸(含50%有效氯)对大竹蛏稚贝24 h半致死质量浓度为12.21 mg/L,安全质量浓度为1.22 mg/L;朱英[14]研究了次氯酸钠对稀有鲫(Gobiocyprisrarus)的毒性影响,指出次氯酸钠消毒剂(有效氯含量1.5%)对稀有鲫急性毒性的96 h半致死质量浓度为25.26 mg/L,对稀有鲫幼体生长的抑制效应质量浓度为15.72 mg/L;张璐等[15]研究了氯和氯胺对桡足类浮游动物灭活效能及机理,指出氯主要通过蛋白质外泄对浮游动物致毒,游离氯对桡足类浮游动物的灭活作用优于化合氯;叶利兰等[16]指出,含氯制剂大量使用不仅会对单一水生物种造成影响,对水生态系统的群落结构和生态演替也会产生影响,进而影响水生态系统中的物质循环,最终破坏水生态系统的平衡。

拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)属于软甲纲十足目梭子蟹科青蟹属,是三门湾海区重要的经济物种之一。拟穴青蟹在幼蟹期迁移能力较弱,很容易受到污染物的影响[12],笔者以三门湾主要经济养殖动物拟穴青蟹的早期幼蟹为试验对象,根据三门湾核电站温排水前期余氯污染状况调查结果及查阅相关资料,设置温度和余氯质量浓度,通过室内模拟培养,分析温度、余氯及两种因子交互作用对幼蟹存活率的影响,以期为三门湾核电站海水中余氯污染对该海域生物和生态环境的影响提供基础资料,同时为制订沿海电厂温排水排放标准提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料的采集与暂养

试验用拟穴青蟹幼蟹体质量(138±20) mg,收集于浙江省台州市三门县三门湾海区,采苗海区水温25 ℃,未受到温升和余氯胁迫。挑选四肢健全、活力良好的健康幼蟹,用海水仔细冲洗其表面附着物后,放入水箱中暂养5 d,暂养水温(25 ± 0.5) ℃,盐度22.5 ± 0.1。暂养期间充气并投喂适量的卤虫(Artemia),每日定时换水,使其处于自然生活状态。

1.2 试验试剂

游离有效氯的制备:取市售次氯酸钠溶液(分析纯),用蒸馏水稀释100倍,游离余氯质量浓度约1.5 mg/mL,储存于小口棕色瓶中备用。

化合有效氯的制备:取市售氨水溶液(含氨量25%～28%,化学纯)和市售次氯酸钠溶液(分析纯),氨含量约240 mg/mL,氯含量约150 mg/mL。按氨氯质量比3∶1进行反应,取1 mL次氯酸钠溶液缓慢滴入208 μL氨水溶液中,均匀晃动10 min充分混匀,后定容至10 mL,所得化合有效氯制备液含量约15 mg/mL,储存于小口棕色瓶中备用。

以上备用液皆临用时配制。

试验于浙江省海洋水产养殖研究所清江基地进行。试验用海水为经24 h沉淀和砂滤后的乐清湾海域天然海水。经游离性余氯比色测定法检测,海水本底不含游离氯和化合氯。

1.3 试验设计

25 ℃是三门湾海域拟穴青蟹幼蟹大量出现季节的水温,也是幼蟹生长的最适水温,核电站温排水普遍温升情况为2～12 ℃[12,17-19],三门湾核电站排水温较排水口自然温度高7 ℃[20],为使试验设计更科学严谨,采取在25 ℃基础上,温度提升5 ℃和10 ℃,来设计本试验温度梯度。试验以25 ℃为对照组,以30 ℃和35 ℃为温升组,共设置3个温度梯度。根据三门湾海区余氯调查报告和预试验结果,设置6个初始游离余氯质量浓度梯度(0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/L),6个初始化合余氯质量浓度梯度(加氨对照组1.575×10-3mg/L NH4OH[1]、30.0、36.0、42.0、48.0、54.0 mg/L)。通过3×12的正交试验研究温度和游离余氯、温度和化合余氯共同胁迫于幼蟹的急性毒性效应。每一个水温条件下的余氯质量浓度梯度均设置3个平行,每个平行投放20只幼蟹,即每个质量浓度组共有60只幼蟹。所用容器为108个500 mL烧杯,试验处理96 h,其间充气活水,每日换水1次,投喂卤虫1次,并于换水后重新添加相应的游离余氯、化合余氯试剂。在试验中每6 h观察记录幼蟹的活动情况、中毒症状和死亡情况,及时捞出死亡个体。按照文献[21]的方法,用玻璃棒触及头部和附肢无任何反应作为死亡的判别标准。

1.4 余氯测定方法

采用法国PONSEL便携式水质分析仪(Mul-ty8302)及其配套试剂测定海水中余氯的含量(国家环境保护标准HJ 586—2010,游离性余氯比色测定法,量程0.1～6.0 mg/L)。

1.5 数据分析

用概率单元法[22]计算不同温度条件下游离余氯和化合余氯96 h的半致死质量浓度(LC50)及95%置信区间,参照文献[10]的方法计算对应安全质量浓度,安全质量浓度(SC)计算公式为:SC=96 h LC50× f,f值取0.1。数据以平均值±标准差表示,当方差齐性时采用Tukey进行多重比较,当方差不齐时采用Dunnett′s T3进行多重比较,分析各组死亡率是否具有显著性差异,当P<0.05时统计具有显著性差异;以单因素方差分析检验相同温度下余氯质量浓度对幼蟹死亡率的显著性差异,以双因素方差分析(SPSS 22.0)检验温度和余氯质量浓度对幼蟹死亡率的显著性差异,P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 余氯质量浓度日变化

余氯质量浓度日变化见图1。初始质量浓度为5.0 mg/L的游离余氯质量浓度日变化为0.76～5.00 mg/L,初始质量浓度为6.0 mg/L的游离余氯质量浓度日变化为0.91～6.00 mg/L,初始质量浓度为7.0 mg/L的游离余氯质量浓度日变化为1.88～7.00 mg/L,初始质量浓度为8.0 mg/L的游离余氯质量浓度日变化为2.68～8.00 mg/L,初始质量浓度为9.0 mg/L的游离余氯质量浓度日变化为3.32～9.00 mg/L。初始质量浓度为30.0 mg/L的化合余氯质量浓度日变化为21.5～30.0 mg/L,初始质量浓度为36.0 mg/L的化合余氯质量浓度日变化为27.1～36.0 mg/L,初始质量浓度为42.0 mg/L的化合余氯质量浓度日变化为33.6～42.0 mg/L,初始质量浓度为48.0 mg/L的化合余氯质量浓度日变化为41.5～48.0 mg/L,初始质量浓度为54.0 mg/L的化合余氯质量浓度日变化为45.0～54.0 mg/L。

图1 余氯日变化曲线Fig. 1 Diurnal variation curve of residual chlorine

2.2 温度对幼蟹的影响

在单一的温度胁迫96 h急性毒性试验中,对照组海水(25 ℃)和温升组海水(30 ℃和35 ℃)条件下,幼蟹的96 h累积平均死亡率分别为(5.0±5.0)%、(3.3±2.9)%和(5.0±0)%,单因子方差分析结果表明,96 h内不同温度试验条件对幼蟹的死亡率无显著性影响(P>0.05)(表1)。

表1 不同温度条件对拟穴青蟹幼蟹死亡率的影响

2.3 余氯对幼蟹的急性毒性

在25 ℃时,游离余氯和化合余氯对幼蟹的急性毒性死亡结果见图2、图3。当幼蟹暴露于游离余氯或化合余氯不同时间(24、48、72、96 h)后,幼蟹的死亡率与余氯质量浓度表现出显著的剂量-效应关系,即在相同的暴露时间下幼蟹的死亡率随游离余氯质量浓度、化合余氯质量浓度的升高而显著上升。而且游离余氯和化合余氯对幼蟹的毒性作用也与暴露时长呈显著正相关,在相同质量浓度下,游离余氯和化合余氯的毒性作用随暴露时间的增加而增强。

图2 25 ℃下游离余氯对拟穴青蟹幼蟹死亡率的影响Fig. 2 The influence of free residual chlorine on the mortality rate of juvenile mud crab S. paramamosain at 25℃

图3 25 ℃下化合余氯对拟穴青蟹幼蟹死亡率的影响Fig. 3 The influence of combined residual chlorine on the mortality rate of juvenile mud crab S. paramamosain at 25 ℃

2.4 温度和余氯耦合对幼蟹的急性毒性

在不同温度条件下游离余氯、化合余氯对拟穴青蟹幼蟹的96 h死亡率和96 h半致死质量浓度影响见图4、图5、表2。与对照组(25 ℃)相比,各温升试验组游离余氯或化合余氯对幼蟹的急性毒性显著增强,且随着温度的升高呈现出递增趋势。游离余氯和化合余氯在35 ℃时表现对幼蟹的最强毒性,96 h半致死质量浓度分别为4.455 mg/L和27.290 mg/L,明显高于其在25 ℃和30 ℃时对幼蟹的毒性(游离余氯在温度为25 ℃和30 ℃时的96 h半致死质量浓度分别为5.437 mg/L和4.854 mg/L,化合余氯在温度为25 ℃和30 ℃时的96 h半致死质量浓度分别为32.943 mg/L、29.415 mg/L)。随着温度的升高,游离余氯、化合余氯对幼蟹的急性毒性分别增加了近1.22、1.20倍,幼蟹在温度高时表现出对更低剂量的余氯敏感。化合余氯对幼蟹的96 h半致死质量浓度约为游离余氯的6倍。

图4 温度和游离余氯胁迫下拟穴青蟹幼蟹96 h死亡率Fig. 4 Influence of temperature and free residual chlorine on 96 h mortality rate of juvenile mud crab S. paramamosain

图5 温度和化合余氯胁迫下拟穴青蟹幼蟹96 h死亡率Fig. 5 Influence of temperature and combined residual chlorine on 96 h mortality rate of juvenile mud crab S. paramamosain

表2 各温度条件下余氯对拟穴青蟹幼蟹的半致死质量浓度及安全质量浓度

对不同温度条件下不同初始游离余氯质量浓度和初始化合余氯质量浓度拟穴青蟹幼蟹死亡率进行双因素方差分析见表3。结果显示,温度与游离余氯对幼蟹死亡率存在交互作用(P<0.05)、温度与化合余氯对幼蟹死亡率不存在交互作用(P>0.05)。

表3 双因素方差分析结果

2.5 幼蟹死亡率与温度、余氯质量浓度的关系

25 ℃时,每提升单位初始质量浓度游离余氯造成死亡率增加8.57%,每提升单位初始质量浓度化合余氯造成死亡率增加1.43%;30 ℃时,每提升单位初始质量浓度游离余氯造成死亡率增加11.67%,每提升单位初始质量浓度化合余氯造成死亡率增加1.54%;35 ℃时,每提升单位初始质量浓度游离余氯造成死亡率增加11.73%,每提升单位初始质量浓度化合余氯造成死亡率增加1.70%(图6、图7)。以每提升单位初始质量浓度游离余氯或单位初始质量浓度化合余氯造成的96 h死亡率增加值与温度做线性回归分析,每1 ℃温升和1.0 mg/L游离余氯增加导致死亡率增加0.316%,每1 ℃温升和1.0 mg/L化合余氯增加导致死亡率增加0.027%。游离余氯和温升耦合导致的幼蟹死亡率提高量为化合余氯的11.7倍。

图6 不同温度下96 h死亡率与初始游离余氯质量浓度线性回归分析Fig. 6 The linear regression analysis of 96 h mortality and initial free residual chlorine concentration at different temperatures

3 讨 论

3.1 温度对幼蟹存活的影响

适温范围内,温度升高能促进蟹类的生长发育、繁殖代谢以及生理生化功能,但温度过高会对蟹类存活产生影响。将拟穴青蟹从25 ℃开始逐级升温(梯度为5 ℃),在30、35、40 ℃时拟穴青蟹未死亡,最后移入43 ℃水体中,忍受49 min后死亡;未经过驯化的拟穴青蟹在38 ℃忍受10 min后死亡[23]。黄海涛[4]研究了温度、盐度、溶解氧、氨氮、亚硝态氮对拟穴青蟹蜕壳的影响,结果表明,拟穴青蟹存活温度为15～35 ℃,蜕壳温度为20～35 ℃,蜕壳的适宜温度为25～35 ℃;黄良民等[23]研究了急温升对10种甲壳动物存活率的影响,结果表明,拟穴青蟹适温范围较广,在15～33℃水体中均能正常活动,当移入35 ℃水体中,2 min后出现不适症状,10 min后活动逐渐正常。本试验为模拟温排水急温升试验,试验对象未经过驯化,所设置的温度梯度对拟穴青蟹幼蟹的存活率无显著性差异(P>0.05),应是试验所设置的温度梯度尚在拟穴青蟹幼蟹的适温范围内,这说明三门湾核电站海区中仅温升条件不足以造成拟穴青蟹幼蟹死亡率明显提升。

3.2 余氯对幼蟹的急性毒性

余氯对水生动物的鳃有损伤作用,使得鳃组织发生病变,如组织增生、上皮组织脱离、鳃中积累大量黏液、生成动脉瘤,从而影响并阻碍鳃与水中溶解氧的交换[11,24]。余氯也可通过蟹鳃组织渗入血淋巴中,由于余氯氧化性较强,它会把血淋巴中能携带氧的还原性血蓝蛋白氧化成不能携带氧的二价铜血蓝蛋白,还可能抑制二价铜血蓝蛋白还原性酶的活性,从而导致血淋巴运载氧的能力下降[25-26]。Valarmathi等[27]发现,余氯会抑制相手蟹(Sesarmaquadratum)的耗氧率,这也证实了上述说法。

25 ℃是拟穴青蟹繁殖季节时三门湾核电站温排水附近海区的平均水温。在25 ℃情况下,游离余氯和化合余氯对拟穴青蟹幼蟹的24 h半致死质量浓度分别为9.62、53.57 mg/L,化合余氯对幼蟹的24 h半致死质量浓度是游离余氯的5.6倍;48 h半致死质量浓度分别为7.93、45.76 mg/L,化合余氯对幼蟹的48 h半致死质量浓度是游离余氯的5.8倍;96 h半致死质量浓度分别为5.44、32.94 mg/L,化合余氯对幼蟹的96 h半致死质量浓度是游离余氯的6.1倍。余氯对不同物种的急性毒性作用具有很大的差异性,例如:游离余氯对平鲷(Rhabdosargussarba)、黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)的48 h半致死质量浓度分别为0.19 mg/L和0.18 mg/L,化合余氯对平鲷、黑鲷的48 h 半致死质量浓度分别为0.56 mg/L和0.60 mg/L[1],游离余氯对大竹蛏稚贝24 h半致死质量浓度为12.21 mg/L,对中华水蚤(Calanussinicus)30 min半致死质量浓度为4.89 mg/L,对蒙古裸腹溞(Moinamongolica)30 min半致死质量浓度为3.92 mg/L[13,28]。拟穴青蟹幼蟹对余氯的耐受性不同于鱼类和贝类,这可能源于生物生存环境的温度、溶解氧、水层、大气压、光照等因子不同所致或者可能与不同物种自身解毒能力、耐受程度和保护功能有关[29]。

游离余氯和化合余氯对水生动物毒性作用的相对强弱根据物种而各有不同。何琴燕等[30]研究认为,对于浮游动物和浮游植物,化合余氯的毒性要比游离余氯强。Brungs[31]认为,鱼类中游离余氯和化合余氯的毒性并无明显差异。但也有很多研究表明,游离余氯的毒性明显强于化合余氯,如Brooks等[2]对几种鱼分别进行短时间浸毒(15、30 min)和间歇性氯冲击(4×30 min,每隔6 h 1次),结果发现,游离余氯的毒性比化合余氯大3～4倍。Heath[8]模拟电厂氯处理方式,对几种淡水鱼进行3×45 min(每隔8 h 1次)的间歇性氯冲击,结果显示,游离余氯的毒性是化合余氯的3～14倍。本试验结果显示,游离余氯毒性约为化合余氯毒性的6倍。不同海域,余氯的存在形态不同,大亚湾海域余氯在海水中形态主要为化合态[32],而三门湾海域余氯在海水中的形态主要是游离态,因此,评价温排水中的余氯对水生环境及水生生物的影响时,应考虑不同海域余氯的主要形态和不同形态余氯的毒性差异。

3.3 温度升高和余氯耦合对幼蟹的急性毒性

4 结 论

在三门湾海区温度梯度内(25～35 ℃),96 h温度胁迫对拟穴青蟹幼蟹的存活率无显著影响(P>0.05)。温度和余氯耦合下,温度升高同时增强了游离余氯和化合余氯对拟穴青蟹幼蟹的急性毒性,幼蟹在温度升高时表现出对更低质量浓度余氯敏感。游离余氯和化合余氯25 ℃时96 h半致死质量浓度分别为5.437、32.943 mg/L,30 ℃时分别为4.854、29.415 mg/L,35 ℃时分别为4.455、27.290 mg/L,表明游离余氯对幼蟹的急性毒性约为化合余氯的6倍。96 h内,每1 ℃温升和1 mg/L游离余氯增加导致死亡率增加0.316%,而每1 ℃温升和1 mg/L化合余氯增加导致死亡率增加0.027%,温升耦合游离余氯下拟穴青蟹幼蟹死亡率提高值明显高于化合余氯。基于96 h半致死质量浓度,25～35 ℃,游离余氯安全质量浓度为0.446～0.544 mg/L,化合余氯安全质量浓度为2.729～3.294 mg/L。