邻苯二甲酸酯对育龄人群及其子代生殖健康影响的研究进展

林彩云，尹飞飞，王惠子，杨 华

（1.海南省妇女儿童医学中心，海南 海口 570206；2.海南医学院热带转化医学教育部重点实验室，海南 海口 571199；3.海南医学院-香港大学热带传染病联合实验室，海南 海口 571199）

近年来，我国在经历社会经济飞速发展的同时，育龄妇女总和生育率却呈现持续下降的趋势。第7 次全国人口普查数据显示，我国育龄妇女总和生育率仅为1.3%［1］，这表示我国已进入全球低生育率国家行列。同时，我国育龄夫妇不孕不育率高达15.6%［2］，自然流产率已达15%［3］。因此，确定新的影响育龄人群生殖健康可干预的因素，将在很大程度上降低生育率的下行风险，具有重大的社会经济发展和公共卫生意义。除年龄和遗传因素之外，目前大量证据表明，食物、水、空气和消费品中合成和天然存在的环境化学物质也可导致生育能力受损［4］。值得关注的是，环境内分泌干扰化合物（endocrine-disrupting chemicals，EDCs）已成为继“温室效应”和“臭氧层破坏”之后又一严重的全球性环境公害问题，被称为“第三代环境污染物”。多项证据表明，EDCs 通过与激素受体相互作用、干扰激素作用或改变激素合成、释放、转运或代谢过程来破坏人体的内分泌功能，可能直接或间接损害生殖系统的发育和功能［5-7］。研究发现，全氟和多氟烷基化物（PFASs）、双酚A（bisphenol A）、有机磷农药（organopesticides，OPs）、拟 除 虫 菊 酯 类 农 药（pyrethroids，PYRs）与育龄女性生育力下降显著相关。然而，关于使用量与日剧增的新型环境污染物，如新型塑化剂-邻苯二甲酸酯（phthalates，phthalate acid esters，PAEs）等对育龄夫妇生育能力影响的研究总体非常有限，且当前PAEs 及新型替代品在生殖健康的人群流行病学研究尚存在争议，毒性机制仍处于探索阶段。本文就当今国内外关于PAEs 对人群及各类动物生殖系统的各种影响的研究进展进行总结，以期将来更加深入探讨PAEs 与育龄人群生殖健康的关系。

1 邻苯二甲酸酯的介绍

PAEs，又称酞酸酯，是邻苯二甲酸形成酯的总称。常温下为无色透明油状粘稠液体，不易挥发，难溶于水而易溶于有机溶剂，属于中等极性物质［8，9］。PAEs 是一种常用塑料制品中的增塑剂，普遍存在于玩具、食品包装、建筑材料、电子与医疗部件、个人护理产品、办公学习用品等塑料包装产品中［10］。PAEs 可分为两类：低分子量（low molecular weight phthalates，LMWP，PAEs≤6 个碳链）、高分子 量（high molecular weight phthalates，HMWP，PAEs＞6 个碳链）［11］。邻苯二甲酸二酯（2-乙基己基，di-2（ethylhexyl）-phthalate，DEHP）是产量最大的一种PAEs 化合物，也是近年来研究报道的热点。由于PAEs 与塑料制品以一种非共价的方式结合，而且其使用年限长、易受紫外光等因素变化的影响，故其很容易释放或迁移到周围环境介质中［12］，从 而 广 泛 存 在 于 土 壤［13］、水［14］、室 内 灰 尘［15］和 食物［16］等生态环境里，因此被认为是一种新型环境污染物。多项研究显示，PAEs 不仅能造成环境及水源的污染，还因其具有生殖毒性、遗传毒性、免疫毒性、神经毒性、致畸、致癌等多种毒性作用［17］，所以对人类健康尤其是对育龄人群及其子代生殖健康的影响不容忽视。

2 PAEs 对亲本生殖健康的影响

2.1 对雌性生殖系统的影响

PAEs 的暴露对不同种系雌性动物的生殖器官均可产生影响，可能破坏雌性生殖器官和相关生殖细胞，使生殖组织形态发生改变并影响类固醇激素水平，导致雌性生殖系统的发育和功能异常，最终影响后代的生长发育。

2.1.1 对雌性生殖器官的影响 在人群研究方面有一项国内女性邻苯二甲酸酯暴露与卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）相关性的病例对照研究［18］发现大多数女性尿液中的邻苯二甲酸酯代谢物浓度与血清雌二醇水平呈显著反比关系，而与血清卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，FSH）水平呈正比关系，该结果表明接触某些邻苯二甲酸酯可能会损害卵巢功能并增加女性卵巢早衰的概率。另一项国外基于原发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）女性与邻苯二甲酸正丁酯（mono-butyl phthalate，MBP）或其代谢物浓度的横断面病例对照研究［19］中发现POI 的女性血清中邻苯二甲酸酯代谢物水平呈正相关，其中MBP 为最重要的一种，并且可能是POI 发生发展的一个危险因素。虽然已有一些学者提出邻苯二甲酸酯会对卵巢功能产生不利影响，但在人群中的流行病学研究还非常有限。

在动物研究方面有许多与影响雌性生殖器官相关的报道，其中包括鹌鹑、斑马鱼、小鼠、大鼠等。Li 等［20］通 过 对 鹌 鹑 暴 露 于DEHP 及 其 主 要 代 谢 物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（mono-（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP）后对卵巢的作用进行研究，发现二者经过受体介导的信号通路可以进一步抑制雌激素的产生；另外还可以通过干扰下丘脑-垂体-卵 巢 轴（hypothalamic - pi - tuitary - ovarian axis，HPOA）的调控来抑制性激素的合成，从而引起性激素 分 泌 障 碍。Park 等［21］通 过 对21 d 雌 性 斑 马 鱼 暴露于不同剂量（0、2、10 和50 μg/mL）MEHP 后的研究发现，所有MEHP 暴露组中体内雌二醇及孕激素水平均显著增加，而暴露于剂量50 μg/mL MEHP中雌性斑马鱼排卵的数量明显下降。Liu 等［22］研究发现暴露于DEHP 的哺乳期雌性小鼠（母代和F1代）卵巢中17β-羟甾类固醇脱氢酶（17-beta dehydrogenase 1，HSD17B）的表达水平显著下调，并进一步降低了血清与卵巢中雌激素的产生；不仅如此，卵巢中的DNA 损伤标志物γH2AX 的比例呈上升趋势，卵巢的凋亡水平也随之出现上升，同时卵巢细胞的增殖表现为抑制状态。Chen 等［23］将成年雌性斑马鱼暴露于邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）以及二者联合暴露30 d，通过对以上3 组的卵巢组织学、性激素水平及卵巢转录组学的研究发现，在DBP 和DIBP 暴露组中，雌二醇水平均显著降低，而晚期/成熟卵母细胞的百分比也表现为显著下降；有趣的是，在联合暴露下并没有表现出显著的影响；而在转录组学测序时，联合暴露组中卵巢的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）在分子水平表现出潜在的生殖毒性，这表明联合暴露组可能通过介导相关信号通路中关键基因的转录，从而破坏雌性斑马鱼的繁殖能力。Fu等［24］通 过 连 续30 d 暴 露 于DEHP 的ICR 小 鼠 的 随机对照研究发现，DEHP 的暴露可引起显著的生殖毒性，主要表现为卵巢器官系数、雌激素水平均显著降低。Takai 等［25］通过对雌性大鼠分别予以持续2 周和4 周口服剂量水平各为0、300、1 000 和3 000 mg/kg DEHP 的毒性的研究中发现卵巢、子宫、阴道均有组织病理学异常，其中暴露于300 mg/kg 或以上剂量暴露组出现卵巢间质细胞空泡化；而暴露于1 000 mg/kg 及以上剂量暴露组则发现卵巢闭锁卵泡增加；在为期4 周的观察中，3 000 mg/kg 剂量暴露组出现新黄体减少、子宫萎缩、阴道上皮细胞变薄及粘液化；另外在生育能力方面的观察中，接触DEHP 后各剂量暴露组的平均发情周期延长：在3 000 mg/kg 剂量暴露组中出现发情周期不规则，其余剂量暴露组的发情周期均在正常范围内。Chiang等［26］在一项对成年雌性CD-1 小鼠口服DEHP 或邻苯二甲酸二异壬酯（diisononyl phthalate，DINP）后进行育种的试验中发现，给药后立即育种并没有影响小鼠的生育能力；但在给药3 个月后，DEHP 和DINP 的暴露均降低了雌性小鼠的受孕能力；此外，DINP 的暴露还破坏了雌性小鼠的发情周期；在给药9 个月后的DINP 暴露仍在显著破坏雌性小鼠的发情周期，并缩短了其与雄性小鼠的交配时间。Somasundaram 等［27］通过对处于哺乳期的F1 代雌性大鼠灌胃DEHP（1、10、100 mg·kg-1·d-1）的研究发现，其成年雌性大鼠的卵巢和子宫的重量明显下降；同时对卵巢的结构也产生影响，表现为卵巢颗粒细胞排列解体、卵母细胞形态发生改变；该研究发现黄体细胞数量呈下降趋势，间质间隙增加，并且伴有血清雌二醇、睾酮及孕酮水平的明显下降，这表明哺乳期暴露于DEHP 可损害雌性大鼠的生殖系统。以上研究表明，PAEs 的暴露对不同种系雌性动物的生殖器官均可产生影响，导致其生殖系统产生不同程度的损害。

2.1.2 对卵子质量的影响 在人群研究方面，现有研究表明PAEs 通过干扰内源性类固醇激素的合成与代谢、破坏卵泡的生长模式、增加氧化应激并导致卵泡死亡，从而加速卵巢的衰老［28］。在一项针对194 名女性卵泡液的横断面研究［29］中发现所有卵泡样品中均能检测到大多数的PAEs 代谢物，进一步分析发现PAEs 的代谢产物中的MBP 和邻苯二甲酸单（2-乙基-5-羟基已基）酯（mono-2-ethyl-5-hydroxylhexyl phthalate，MEHHP）与卵巢类固醇激素呈正相关，这也证明了卵泡液中的PAEs 代谢物与卵泡内生殖激素水平改变有关。这与当前PAEs 通过干扰内源性类固醇激素的合成与代谢、加速卵巢衰老的研究结果一致。在寻求助孕治疗的育龄女性中，PAEs 暴露与窦卵泡计数（antral follicle counting，AFC）显著降低［30，31］和卵母细胞产生下降［32-34］有关。但Du 等［35］的一项研究中发现卵泡液或尿液代谢物浓度与卵母细胞产生之间无关。并且，Du等［36］在一项基于415 名不孕育龄女性的回顾性分析发现，尿液中PAEs 代谢物浓度与与血清抑制素b（inhibin-b，INH-b）水平之间存在负相关，但其与血清抗苗勒氏管激素（anti-mullerain hormone，AMH）水平之间无关。Sacha 等［37］观察到PAEs 代谢物的尿液浓度与接受助孕治疗女性的排卵前卵泡液中的AMH 浓度之间呈负相关，并可能对窦卵泡募集和生育结局有影响。可见，现有的关于PAEs 暴露与育龄期女性卵泡的发生发育及生殖内分泌激素水平之间关联性的研究尚存在争议。

在动物实验研究方面，一项针对雌性SD 大鼠后代（暴露于1、20、50 或300 mg DEHP ·kg-1·d-1）的研究［38］发现，在胚胎时期接触DEHP 会导致成年后雌二醇水平在发情期出现下降，而促卵泡激素水平在发情期前后都表现出明显升高的趋势；在接触DEHP 剂量为50 mg·kg-1·d-1及以上时，卵泡膜细胞层厚度出现下降；在生育能力上，F1 代的繁殖并不受影响，而在接触剂量为20 mg DEHP·kg-1·d-1时，F3代中表现为产崽数增加，幼崽体重下降；因此，尽管产生以上影响，但也并不会导致后代不育的结局。Liu 等［39］通过灌胃的方式将DEHP（0、100、400 和1 600 mg·kg-1·d-1）对21 d 日龄的ICR 小鼠进行持续6周的染毒，研究结果显示卵泡发育相关因子（包括ckit，kitl，gdf9 和atm）的表达显著降低；然而，卵巢miRNA（let-7b，miR-17-5p miR-181a 和miR-151）的表达量却明显升高，表明PAEs 可抑制卵泡颗粒细胞的增殖。Xu 等［40］通过向雌性大鼠持续灌胃600 mg/kg DEHP 60 d 的研究发现，被染毒雌性大鼠的卵巢内卵泡数量减少，闭锁卵泡显著增加。同样，FU 等［41］对4 周 龄 的ICR 雌 性 小 鼠 经 过 连 续30 d 胃内注射DEHP 的随机对照研究中发现，DEHP 暴露下的雌性小鼠卵泡数量减少（初级卵泡、次级和窦卵泡减少，初级卵母细胞数量明显减少）。这与Liu等［22］的研究结果一致，表明DEHP 的暴露会影响卵泡的发育。

综上，PAEs 可能通过破坏雌性生殖器官和相关生殖细胞，使生殖组织形态发生改变，以及影响类固醇激素水平，卵泡数量减少，卵子质量下降，导致雌性生殖系统的发育和功能异常，最终影响后代的生长发育。

2.2 对雄性生殖系统的影响

PAEs 暴露会对雄性动物生殖器官及其生殖细胞的发育造成不良影响，不仅导致睾丸及附睾重量下降、睾丸组织损害，还会引起精液质量降低，最终导致雄性生殖能力下降。

2.2.1 对雄性生殖器官的影响 青春期是生殖系统发育成熟的重要时期，对雄性生殖系统发育也具有关键作用。在人群研究方面，既往有关PEAs 类物质产生的生殖毒性与男性生殖器官损害的相关研究均提示两者间具有直接或间接的关系。在国内一项针对年龄在7～14 岁的男孩尿液中PAEs 代谢物的研究中发现，尿液中MBP 水平与睾丸体积呈反比关系；邻苯二甲酸单-（2-乙基-5-氧代己基）酯（mono （2-ethyl-5-oxohexyl）phthalate，MEOHP）水平与阴毛发育也同样为反比关系［42］。一项针对儿童的研究显示，PAEs 暴露与男孩青春期发育存在相关性，尿液样本中邻苯二甲酸单丁酯 （mono-nbutyl phthalate，MnBP）暴露可能与男孩阴毛发育延迟有关［43］。对患有体质性青春发育延迟 （constitutional Delay of Growth and Puberty，CDGP）的儿童与PAEs 暴露相关性的研究发现，CDGP 组儿童的尿液中PAEs 浓度与对照组相比明显升高；并且，尿液中的MBP、邻苯二甲酸单乙酯及总邻苯二甲酸酯浓度与血清睾酮水平表现出显著负相关，表明PAEs 通过降低血清睾酮的水平对CDGP 产生间接影响［44］。

在动物实验研究方面，PAEs 暴露对雄性动物具有明显的生殖毒性，能影响生精过程和动物的生殖内分泌，但相关的机制尚不明确。精子的产生过程包括生精细胞的分化、支持细胞的作用以及雄激素的调节。Zhao 等［45］对青春期前的雄性大鼠经口暴 露DEHP（250 和500 mg·kg-1·d-1）的 研 究 中 观 察到，接触DEHP 可使睾丸组织学恶化，睾丸激素水平降低，睾丸细胞凋亡增加，这提示DEHP 暴露可致睾丸损伤。孙镠佳等［46］对4 周龄ICR 雄性小鼠灌胃染毒DEHP（0.5、50、500 mg/kg）35 d 后，发现在中、高剂量组的小鼠睾丸组织均受到损伤，且在高剂量组中睾丸湿重显著下降。但这一结果与Capela等［47］的研究相反，可能是接触剂量之间的差异所导致。同时，Oudir 等［48］在生后21～120 d 暴露于低剂量DEHP（0.5、50 和5 000 μg·kg-1·d-1）的雄性Wistar大鼠的研究中发现，低剂量的DEHP 暴露不可仅使睾丸和附睾重量下降，精子的数量减少，还可导致睾丸支持细胞的数量降低。此外，Abarikwu 等［49］通过将邻苯二甲酸二正丁酯（1 mL/kg）持续暴露15 d，发现大鼠的生精小管直径、上皮高度、上皮生殖细胞计数和小管长度均明显下降，表明邻苯二甲酸二正丁酯暴露可导致雄性大鼠的睾丸组织受到损害。以上研究均表明PAEs 暴露会对雄性动物生殖器官及其生殖细胞的发育造成不良影响。

2.2.2 对精液质量的影响 在影响男性精液质量方面，在人群中的多项研究与荟萃分析表明，邻苯二甲酸单酯暴露对精子密度和活力下降以及形态异常中水平更高［50］。Xie 等［51］在DBP 及其主要代谢物MBP 与人类精子功能的体外研究中观察到，DBP 和MBP 在精液中高水平积累，可能会通过抑制精子酪氨酸磷酸化，从而进一步损害男性的精子功能。Lidia 等［52］在一项评估105 名受试者的7 种邻苯二甲酸酯代谢物与精液质量的相关性研究中发现，精液量与邻苯二甲酸二壬酯呈负相关，精子浓度与邻苯二甲酸单乙酯呈显著负相关。并且，在动物实验上也证实了这一点，Mondal 等［53］通过对8 周的小鼠进行3 个月低剂量邻苯二甲酸二乙酯暴露的研究中发现睾丸组织结构改变伴随着抗氧化剂比例的紊乱，精子中出现许多结构异常，精子功能下降，说明长期暴露于低剂量邻苯二甲酸二乙酯对精子数量、活力、生存力和形态产生不利影响。Goudarzi 等［54］研究发现，成年雄性小鼠服用DEHP（2 g/kg）后，精子活力明显下降，血清睾酮水平显著降低，提示DEHP 暴露可导致成年期小鼠的睾丸功能遭到破坏。这与孙镠佳等［46］的研究结果一致，该研究发现在剂量500 mg/kg 组的小鼠中附睾精子数量和精子活力等级明显降低。总体来说，PAEs 暴露不仅会导致睾丸及附睾重量下降，睾丸组织损害，还会引起精液质量降低，这些损伤都会造成生殖系统的影响，最终导致雄性生殖能力下降。

3 PAEs 对子代（包括胚胎）生殖发育与遗传毒性的影响

多项人群研究表明，暴露于PAEs 及其代谢物，可干扰子代的正常生长发育，其影响程度随暴露的剂量、暴露持续时间的变化而不同。在一项母体孕期血清PAEs 浓度与男性后代生殖系统长期发育影响的研究中发现，母体孕期血清中DEHP 与DINP代谢物浓度越多，男性睾丸体积越小，因此，母体中PAEs 的浓度可能影响男性后代的生殖功能［55］。在一项针对1 059 对母婴的前瞻性队列研究中发现，母体尿液含量较高的PAEs 与两性青春期早期阴毛发育相关［56］。

在动物实验研究方面，多项研究也能观察到类似的影响结果。Brehm 等［57］通过对比暴露于不同剂量（20 和200 μg·kg-1·d-1以 及500 和750 mg·kg-1·d-1）DEHP 的雌性CD-1 小鼠多代（F1、F2 及F3 代）的卵泡数量、发情周期和性激素水平，发现产前暴露于DEHP 会改变F1 代的发情周期，卵巢囊肿的发生概率升高，总卵泡数下降；在F2 代中不仅缩短了生殖器距离，还改变了卵泡数目以及改变了发情周期；在F3 代中卵泡的生成减少。此外，产前暴露于DEHP 还导致血清雌二醇水平升高（F1 代和F3代）、血清孕激素水平降低（F2 代）、血清睾酮水平降低（F1 代、F2 代和F3）、血清促性腺激素水平发生改变（F1 代和F3 代）以及降低血清INH-b 水平（F1 和F3），这表明产前暴露于DEHP 会对雌性后代产生生殖毒性。Rattan 等［58］针对产前DEHP 暴露的雌性小鼠后代卵巢功能影响的研究中发现，在F1 代中产前接触DEHP 会使其卵巢重量、卵泡生成均下降，雌激素水平升高；在F2 代中不仅卵巢重量下降，还会导致卵泡生成及降低血清孕酮水平；在F3 代则表现为加快始基卵泡的形成，该研究同样提示产前暴露DEHP 会对其子代、甚至多代的卵巢功能产生不利影响。另外，Barakat 等［59］研究发现，对妊娠期CD-1 小鼠给予PAEs 混合物口服直至F1 代雄性小鼠出生当日，评估其生殖功能指标，比较正常雄性小鼠与产前暴露于PAEs 混合物的雄性小鼠性腺、前列腺和精囊，发现12 个月龄后，产前暴露组雄性小鼠的睾丸激素浓度明显下降，睾丸相关的类固醇生成基因的mRNA 表达降低，同时也会导致精子浓度和活力降低，这表明妊娠期暴露于PAEs 混合物对雄性后代可产生长期的影响。而Dobrzyńska 等［60］的研究中发现，将成年雄性小鼠连续8 周暴露于DEHP，其F1 子代的精子数量和质量未见明显异常，但F2 代胎儿死亡率显著升高。Wang 等［61］通过对母体暴露DEHP 后的子代小鼠的卵巢细胞进行单细胞RNA 测序发现DEHP 暴露不仅阻碍了始基卵泡的形成，同时干扰了卵泡的发育，抑制了卵巢颗粒细胞的增殖活性，并进一步激活其死亡的调节。不仅如此，DEHP 暴露还能使转化生长因子-β信号传导介导的卵巢细胞之间的相互作用遭到破坏，使生殖细胞和/或体细胞中的DNA 损伤以及细胞凋亡增加。Ozkemahli 等［62］的一项随机对照实验研究，将妊娠的SD 大鼠通过胃内灌洗DEHP 和双酚A 至哺乳期，发现在混合暴露后，其雌性后代血浆睾酮和雌二醇水平明显降低，黄体数量和原始卵泡数量也明显减少，进一步提示早期联合接触DEHP 和BPA 可能会对其雌性后代的生殖系统造成不良影响。因此，在妊娠期及哺乳期接触PAEs可能对子代的生殖代谢、生长发育及生殖毒性造成不同程度的损害。

4 展望

当前我国育龄女性总和生育率呈现持续下降趋势，除年龄和遗传因素之外，大量证据表明，食物、水、空气和消费品中合成和天然存在的环境化学物质也可导致生育能力受损，而PAEs 暴露可能会对亲本及子代甚至多代的生殖系统造成损害，造成不良的生育结局。近年来，越来越多的研究关注于非持久性内分泌干扰物PAEs 的暴露与女性生殖健康的关联，但对女性生殖毒性相关的研究仍不够全面，PAEs 暴露的剂量对女性生殖系统的影响各有不一，引起毒性反应的最低剂量仍未明确，研究的结论也始终存在争议，一些研究发现育龄女性的PFAS 暴露与生殖激素水平之间没有显著关联［63-66］，而其他研究指出PFAS 具有内分泌干扰效应［67-69］。既往的研究多限于考虑单独PAEs 与生殖健康结局的关联，多种PAEs 混合暴露的效应未知。现有的研究也多局限于动物模型的暴露，且大多为单一的污染物暴露，并不能充分反映人体的实际暴露情况；而人群实际内暴露为多种PAEs 长期低浓度累积效应；加之暴露的来源、水平、途径和剂量均处于未知状态。因此，如何评估人群中PAEs 的暴露水平、如何将多种PAEs 混合暴露的现状在研究中体现、如何确定其产生影响所需的暴露剂量等等是我们接下来需要探索的方向。未来需要进一步设计严谨、考虑多种混杂因素影响的动物毒理模型实验来开展PAEs 暴露致生育力下降的机制研究，来探索PAEs 暴露与育龄人群生育结局的关联性，从而提高育龄人群的生育能力。

总之，深入研究PAEs 暴露对育龄人群生殖健康的影响，确定促进育龄人群及其后代生殖健康中可干预的新因素，从而进一步对其危害性进行精准防控，保护育龄人群的生育健康和子代健康，为推动社会经济发展、保证出生人口健康增长具有重要的公共卫生意义。

所有作者声明不存在利益冲突关系。