千金子二萜醇调控TGF-β/Smad4通路调节肾癌小鼠Th1/Th2免疫平衡

周磊 宋圣佑 邰伦伟 蒋俊玲 王蒙蒙 潘世杰 赵俊峰

(河南中医药大学 1第二临床医学院,河南 郑州 450002;2第二附属医院)

肾细胞癌(RCC)简称肾癌,起源于肾小管上皮细胞,占所有癌症的2%～3%〔1〕。有研究表明,RCC的发生发展与Th1/Th2免疫平衡有很大关系〔2～4〕。另有研究表明,中药千金子的许多相关提取物可以抑制肺癌〔5〕、肝癌〔6〕、宫颈癌〔7〕、白血病〔8〕等肿瘤的进展;本课题组前期研究发现,千金子二萜醇可抑制RCC细胞的增殖、转移和侵袭,并通过体内实验证实其可减缓肿瘤进展、通过调控核因子(NF)-κB活性抑制基质金属蛋白酶(MMPs)表达和通过调节转化生长因子(TGF)-β1/Smad通路活化影响肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-17表达〔9～11〕。但其是否具有调节肾细胞癌Th1/Th2免疫平衡的作用仍不清楚。本研究旨在分析千金子二萜醇调控TGF-β/Smad4信号通路调节肾癌小鼠Th1/Th2免疫平衡及其可能机制。

1 材料与方法

1.1试剂 千金子二萜醇(WKQ-0000424,四川维克奇生物科技有限公司);RPMI1640、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)和Phosphate Buffered Saline(以色列BI公司);青-链霉素混合液(索莱宝公司)、无血清冻存液(C40100,新赛美);高效RIPA裂解液(组织/细胞)(R0010,索莱宝公司)和ECL显影液(索莱宝公司);PEG-300和LY2109761(Med Chem Express公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司);蛋白电泳凝胶制备试剂盒Ⅱ型(PE008-2,陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司);TGF-βR Ⅱ Polyclonal antibody(27212-1-AP,武汉三鹰有限公司);SMAD4 Polyclonal antibody(51069-2-AP,武汉三鹰有限公司);Beta Actin Polyclonal antibody(20536-1-AP,武汉三鹰有限公司);HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00001-2,武汉三鹰有限公司);三色预染蛋白Marker(WJ103,上海雅酶生物医药科技有限公司)IFN-γ Mouse Uncoated ELISA Kit(EK280/3-96,联科生物科技有限公司);鼠IL-4 High Sensitivity ELISA Kit(EK204HS-96,联科生物科技有限公司);柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒(B518651-0100,生工生物工程(上海)股份有限公司);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒(RR047A,宝日医生物技术(北京)有限公司);TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(RR820A,宝日医生物技术(北京)有限公司);

1.2细胞及实验动物 肾癌细胞(北纳创联生物技术有限公司);6～8 周龄雄性SPF级BALB/c小鼠(北京斯贝福生物技术有限公司),体质量18～22 g,于25 ℃、12 h光照/12 h黑暗实验动物中心常规饲养,正常饮食饮水。动物实验经河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)伦理委员会批准。

1.3肾癌细胞培养 将完全培养基中的肾癌细胞恒温培养对数生长期,胰蛋白酶消化,离心,进行细胞计数并制备1×107个/ml细胞悬液用于后续实验。

1.4小鼠分组、肾癌模型构建及给药 取雄性SPF级BALB/c小鼠18只,随机分为模型组(肾癌组)、实验组(模型+千金子二萜醇组)和TGF-β/Smad通路抑制剂组(模型+LY2109761组),每组6只。3组小鼠腋窝(右前肢)皮下组织注射0.2 ml细胞悬液。造模过程在SPF级小鼠饲养室环境中饲养,自由饮水进食。待瘤块体积大于5 mm后,实验组给予25 mg/kg千金子二萜醇溶液灌胃,1次/d;通路抑制剂组给予25 mg/kg LY2109761溶液灌胃,每3 d 1次。给药21 d结束后(实验组给药21次;通路抑制剂组给药7次),腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠,眼科弯头镊摘除小鼠眼球后取血,离心后取上清,置于超低温冰箱冷冻保存,剥离小鼠皮下移植瘤块并置于液氮中冷冻保存,分离各组小鼠完整的脾脏置于液氮中冷冻保存。

1.5瘤块体积增长率计算 灌胃期间测量小鼠第3天和第21天瘤块的长径L(mm)、短径W(mm)。肿瘤体积(mm3)=π/6×L×W2,瘤块增长率=(第21天肿瘤体积-第3天肿瘤体积)/第3天肿瘤体积×100%,并进行分析。

1.6Western印迹检测小鼠脾脏组织蛋白表达 取米粒大小的小鼠脾脏组织放入蛋白裂解液中提取总蛋白,采用BCA法定量蛋白浓度。将蛋白液转移至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),依次进行分离、转膜、取膜和清洗,随后加入一抗、二抗孵育,最后采用ECL显色法显影并检测蛋白质条带,以β-actin为内参,分析条带灰度值,检测TGF-βR Ⅱ和smad4蛋白含量。

1.7ELISA检测IL-4和IFN-γ水平 从超低温冰箱取出小鼠血清,将ELISA试剂盒及实验物品平衡至室温,采用ELISA检测血清IL-4和IFN-γ水平,严格按照试剂盒操作说明书进行。

1.8RT-qPCR检测各个蛋白的mRNA 根据柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒操作步骤提取小鼠脾脏组织的mRNA,根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒将所提取的mRNA逆转录合成cDNA。用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)试剂盒进行目的基因TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA(以β-Actin为内参)的qPCR扩增,引物序列为:β-actin mRNA正义:5′-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3′,反义:5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′;TGF-βR Ⅱ mRNA正义:5′-GACCTCAAGAGCTCTAACATCC-3′,反义:5′-GTCATCCACAGACAGAGTAGG-3′;Smad4 mRNA正义:5′-AGTTCACAATGAGCTTGCATTC-3′,反义:5′-TTCAAAGTAAGCAATGGAGCAC-3′;IFN-γ mRNA正义:5′-CTTGAAAGACAATCAGGCCATC-3′,反义:5′-CTTGGCAATACTCATGAATGCA-3′;IL-4 mRNA正义:5′-TACCAGGAGCCATATCCACGGATG-3′,反义:5′-TGTGGTGTTCTTCGTTGCTGTGAG-3′。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根据2-△△Ct进行TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA表达的相对定量分析。

1.9统计学分析 使用Graphpad Prism9.5软件进行单因素方差(非参数检验)分析。

2 结 果

2.1各组肿瘤体积增长率比较 与模型组比较,实验组和LY2109761组肿瘤体积增长率均显著降低(P<0.05),见表1。

表1 各组肾癌小鼠肿瘤体积增长率,血清IFN-α、IL-4,脾脏组织TGF-βRⅡ、Samd4蛋白表达比较

2.2各组血清IFN-γ和IL-4水平比较 与模型组比,实验组IFN-γ显著升高,IL-4水平显著降低(P<0.05),见表1。

2.3各组脾脏组织TGF-βR Ⅱ、Samd4蛋白表达比较 与模型组比较,实验组和LY2109761组TGF-βR Ⅱ、Samd4和蛋白水平均显著降低(P<0.05),见表1、图1。

图1 各组脾脏组织TGF-βR Ⅱ、Samd4蛋白表达水平

2.4各组脾脏组织TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA表达比较 与模型组相比,实验组TGF-βR Ⅱ、Smad4 mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01); LY2109761组TGF-βR Ⅱ mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,实验组IFN-γ mRNA表达水平显著升高(P<0.05), IL-4 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),见表2。

表2 各组脾脏组织TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA的表达水平

3 讨 论

20%～30%的肾癌患者在诊断早期发生转移,5年存活率极低〔12〕。许多传统中草药能稳定肿瘤生长,对改善肾癌的防治有重要临床意义。研究报道,某些中药和相关活性化合物具有有效的抗癌特性〔13〕,千金子二萜醇是传统中草药千金子Semen euphorbiae lathyridis中的主要抗癌单体。已有研究表明,千金子二萜醇通过调控上皮间质转化过程显著抑制非小细胞肺癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力〔5〕,通过调节细胞凋亡、增殖分化、转录、细胞周期等多种途径来治疗白血病〔8〕。本课题组前期研究也发现千金子二萜醇可以通过诱导肾癌细胞凋亡及阻断其在细胞生长周期的G0/G1期来抑制肾癌细胞的增殖〔9,14〕。

癌症的发展通常伴随着Th1/Th2免疫失衡发生〔15〕。Th1向Th2漂移是恶性肿瘤的特有现象,Th2型细胞因子的优势状态将导致机体抗肿瘤免疫功能减弱,保护肿瘤细胞逃逸免疫监视和免疫攻击,这可能是肾癌发生发展的免疫机制之一〔16〕。 Th1细胞介导、参与细胞免疫和局部炎症反应,其分泌的INF-γ具有多种免疫调节作用,可以抑制肿瘤细胞生长〔17〕,Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,介导体液免疫,并与超敏反应的发生密切相关〔17〕,可通过抑制IL-12、IFN-γ的产生,防止NK细胞活化,减少肿瘤细胞抗原表达等方式抑制细胞免疫的抗肿瘤效应。本研究结果说明千金子二萜醇触发了Th1/Th2失衡,并将Th1/Th2免疫平衡向Th1转移。

TGF-β/Smad4是细胞内重要的信号通路,参与调控多种重要的生物学过程,在多种肿瘤中均发挥重要作用。在TGF-β信号传导的第一步中,TGF-β配体与Ⅱ型受体(TGF-βR Ⅱ)和Ⅰ型受体(TGF-βR Ⅰ)的异聚体复合物结合,3种异构体均以同源二聚体的形式结合到TGF-βR Ⅱ上,TGF-βR Ⅱ磷酸化并激活TGF-βR Ⅰ。激活的TGF-βR Ⅱ依次磷酸化并激活受体激活的Smads(R-Smads)、Smad2和Smad3。Smad7与R-Smads竞争与TGF-βR Ⅰ的相互作用,从而阻止R-Smad激活和信号的正确传播。活化的R-Smads与TGF-βR Ⅰ分离,与共同的介体Smad4形成复合物。三聚体复合物易位到细胞核,在细胞核里与高亲和力DNA结合转录因子和染色质重塑蛋白结合,促进或抑制靶基因的转录〔18〕。LY2109761是一种新型的选择性TGF-βR Ⅰ/Ⅱ 型抑制剂,能选择性通过抑制TGF-βR Ⅰ和TGF-βR Ⅱ的结合发挥作用〔19〕。本研究结果说明LY2109761抑制TGF-βR Ⅱ可能在翻译水平,LY2109761组Smad4蛋白水平表达降低,可能是由于膜受体蛋白TGF-βR Ⅱ表达量降低,阻止了信号从膜外向膜内的信号转导,导致Smad2/3和Smad4蛋白表达量降低,同时抑制型Smad7表达量上升,进一步抑制了信号向核内的传递,从而有效抑制了TGF-β1/Smads信号通路〔20〕。说明千金子二萜醇调节肾癌小鼠Th1/Th2免疫平衡的机制可能与TGF-β/Smad4信号通路有关。

综上,肾癌会引起IFN-γ降低和IL-4升高,从而影响机体免疫反应诱发免疫抑制,而千金子二萜醇可以影响Th1/Th2的免疫平衡,将Th1/Th2免疫平衡向Th1转移,促进IFN-γ的分泌和抑制IL-4的分泌,解除免疫抑制,进而影响肾癌进展,其机制可能与TGF-β/Smad4信号通路有关。