左炔诺孕酮联合miRNA-21-5p抑制剂对子宫内膜癌细胞增殖、转移的作用及机制

马鸿云 田春花 马钊 吴阳 桂甜甜

(宁夏回族自治区人民医院 宁夏眼科医院,宁夏 银川 750002)

子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤,也是全球女性中第四常见的恶性肿瘤〔1〕。据Evans等〔2〕报道,英国子宫内膜癌的发病率正不断上升。而中国癌症登记处提供的数据显示,中国也观察到类似趋势〔3〕。尽管子宫内膜癌在诊断和治疗方面(包括手术、化疗和放疗)取得相当大的进展〔4〕,但转移性子宫内膜癌的预后仍较差〔5,6〕。因此,有必要寻找新的临床适用的分子靶点和更有效的子宫内膜癌治疗策略。

微小核糖核酸(miRNAs)被发现具有促癌作用〔7〕,并与包括子宫内膜癌在内的许多癌症的进展密切相关〔8〕,多种miRNA已被认为是子宫内膜癌诊断和预后的生物标志物〔9〕。miR-21-5p在多种肿瘤中高表达〔10〕,研究证实,多发性肿瘤抑制基因磷酸酶基因(PTEN)、原肌球蛋白基因(TPM)1、程序性细胞死亡基因(PDCD)4 mRNA的3'非编码区(UTR)均含有miR-21-5p特异性识别和结合位点〔11〕。此外miR-21-5p在前列腺癌中的异常表达还可以促进前列腺癌细胞多药耐药〔12〕。然而,miR-21-5p在子宫内膜癌诊断和治疗中的潜在作用研究尚不多。左炔诺孕酮(LNG)是第二代合成孕激素,是诺孕酮外消旋混合物的生物活性异构体,目前主要作为一线口服紧急避孕药或作为与雌激素联合使用的长期避孕药物〔13〕。研究指出,LNG可以作为子宫内膜癌的初级保守治疗方式,尽管其疗效尚未得到证实,但已有研究指出LNG联合口服孕激素具有较强的抑制子宫内膜癌的作用〔14〕。但LNG对子宫内膜癌的作用机制尚不明确。本研究首次提出LNG与miR-21-5p抑制剂(inhibitor)联合使用抑制子宫内膜癌细胞增殖、转移的方案,为后续临床治疗子宫内膜癌提供新的方法和理论支持。

1 材料与方法

1.1临床样本采集 临床肿瘤标本采自2018年9月至2019年7月在宁夏回族自治区人民医院治疗的子宫内膜癌患者组织10例(均经病理检查确诊),组织标本离体后30 min内置于液氮罐内迅速冷冻保存。

1.2实验细胞 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa购自北纳生物(BNCC338359)。

1.3试剂与仪器 LNG购自Selleckchem公司;Lipofectamine3000购自Invitrogen公司;miR-21 inhibitor和miR-21无关序列(NC)合成于安徽通用公司;Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自联科生物;RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒购自康为世纪公司;PTEN一抗购自abcam(ab170941);结晶紫染色液购自Solarbio;NovoCyteTM流式细胞仪购自艾森生物(杭州)有限公司;多功能酶标仪超高灵敏度化学发光成像系统购自TECAN公司;荧光聚合酶链反应(PCR)仪及超高灵敏度化学发光成像系统购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司;蛋白电泳仪购自北京市六一仪器厂。

1.4免疫组化 烤片,脱蜡,水化,抗原修复,封闭,敷一抗,稀释好的一抗:PTEN(1∶100),4 ℃孵育过夜,敷二抗,滴加辣根酶标记山羊抗兔IgG(1∶100),37 ℃孵育30 min,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水、透明、封片、镜检。

1.5细胞分组处理 将Ishikawa细胞分为4组,对照(Control)组、LNG处理(LNG)组、LNG处理+miR-21 NC(LNG+miR-21 NC)组和LNG处理+miR-21 inhibitor(LNG+miR-21 inhibitor)组。

1.6细胞转染 Ishikawa细胞铺6孔板,加入5 μl lipofectamine3000,混匀后室温孵育15 min,将细胞放回孵箱培养,转染6 h后在6孔板中加入20%血清完全培养基1 ml,48 h后进行检测。

1.7实时荧光定量(qRT)-PCR 荧光PCR仪进行荧光定量PCR。反应体系如下:RNase Free dH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μl。miRNA反应体系如下:RNase Free dH2O 7.2 μl、cDNA 2 μl、上游引物0.4 μl、下游引物10.4 μl、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl。反应步骤如下:预变性 95 ℃,10 min;变性95 ℃,10 s;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40个循环。引物序列由通用生物系统(安徽)有限公司设计合成,引物序列:PTEN正义:TTTTGAAGACCATAACCCACC,反义:TCATTACACCAGTTCGTCCCT;miR-21-5p正义:TAGCTTATCAGACTGATGTTGA,反义:CTACAATAAACGCGACCACG;GAPDH正义:TGACTTCAACAGCGACACCCA,反义:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA;U6正义:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,反义:CGC-TTCACGAATTTGCGTGTCAT。

1.8CCK8检测细胞增殖 Ishikawa细胞中每孔加入10 μl CCK8检测试剂,37 ℃孵育2 h,酶标仪在450 nm波长处检测细胞吸光值并计算存活率。细胞存活率=(实验组细胞OD/对照组细胞OD)×100%〔10〕。

1.9流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞106个,用结合缓冲液重悬细胞,利用Annexin Ⅴ-FITC/PI Apoptosis Kit试剂盒,上NovoCyteTM流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.10细胞划线检测细胞迁移 Ishikawa细胞铺6孔板待密度达到90%以上后进行划线,0 h后给每孔的细胞划痕拍照,24 h后再次给每孔的划痕拍照,进而计算出细胞的迁移速率。迁移速率=迁移距离/迁移时间〔11〕。

1.11Transwell检测细胞侵袭 各组细胞消化收集,离心,计数,每个小室接种细胞5×104个,24 h后去除孔中培养基,结晶紫静置染色1 h,拍照计数。

1.12Western印迹检测 各组细胞加入细胞裂解液,提取总蛋白。根据二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用300 mA恒流转膜80 min。一抗溶液孵育,4 ℃过夜,二抗溶液中室温孵育2 h。在凝胶成像系统中曝光。用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.13统计学分析 采用Graphpad Prism7软件,组间显著性差异采用one-way ANOVA分析。

2 结 果

2.1子宫内膜癌组织PTEN表达 与治疗前(0.160±0.050)相比,LNG治疗后子宫内膜PTEN表达水平(0.377±0.024)明显升高(P=0.000),见图1。

图1 子宫内膜癌组织中PTEN表达(DAB,×200)

2.2LNG作用浓度与时间选择 与0 μmol/L相比,24、48 h时50、100 μmol/L LNG使细胞活力均明显下降,细胞凋亡率均明显升高且1、5、10 μmol/L LNG 24 h凋亡率亦明显升高(P<0.01)。其中100 μmol/L效果更加明显,因此选择100 μmol/L LNG、24 h进行后续实验。见表1、图2。

表1 LNG作用浓度对不同时间点细胞活力、凋亡的影响

图2 流式检测LNG不同浓度与作用时间的凋亡率

2.3miR-21-5p验证结果 采用qPCR方法验证miR-21-5p inhibitor的转染效果,与Control组(1.000±0.00)和miR-21 NC组(0.809±0.121)相比,miR-21 inhibitor组细胞中miR-21-5p相对表达量(0.754±0.130)明显下降(P=0.026)。

2.4LNG联合miR-21 inhibitor处理后细胞增殖变化 与Control组(100.000±4.161)相比,LNG组细胞增殖活性(79.712±3.734)明显下降;与LNG组相比,LNG+miR-21 inhibitor组细胞增殖活性(55.515±1.655)明显下降(均P<0.01)。

2.5LNG联合miR-21 inhibitor后细胞凋亡变化 与Control组〔(9.803±0.241)%〕相比,LNG组细胞凋亡率〔(18.323±0.318)%〕明显上升;与LNG组相比,LNG+miR-21 inhibitor组凋亡率〔(27.297±0.523)%〕明显上升(均P<0.01)。见图3。

图3 LNG联合miR-21 inhibitor后各组细胞凋亡

2.6LNG联合miR-21 inhibitor后细胞迁移能力变化 与Control组(4.930±1.672)相比,LNG组细胞迁移细胞数〔(2.640±1.028)个〕明显下降;与LNG组相比,LNG+miR-21 inhibitor组细胞迁移细胞数〔(1.043±0.416)个〕明显下降(均P<0.001)。见图4。

图4 LNG联合miR-21 inhibitor后各组细胞迁移(荧光定量染色,×100)

2.7LNG联合miR-21 inhibitor后细胞侵袭能力变化 与Control组(3.819±0.697)相比,LNG组细胞侵袭细胞数〔(2.392±0.234)个〕明显下降(P=0.000);与LNG组(1.206±0.210)相比,LNG+miR-21 inhibitor组细胞侵袭细胞数〔(0.801±0.124)个〕明显下降(P<0.01)。见图5。

图5 各组细胞侵袭能力(结晶紫染色,×100)

2.8各组细胞中miR-21-5p、PTEN、磷脂酰肌醇-3(PI3K)、p-PI3K、AKT和p-丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)表达 与Control相比,其他3组miR-21-5p表达明显下调;与LNG相比,LNG+miR-21 inhibitor组miR-21-5p表达明显下降(P<0.01)。与Control相比,其他3组p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K表达明显下降,PTEN表达明显升高;与LNG组相比,LNG+miR-21 inhibitor组p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值明显下降,PTEN表达明显升高(均P<0.01)。见表2、图6。

表2 各组细胞中miR-21-5p、PTEN、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT表达

1～4:Control组、LNG组、LNG+miR-21 NC组、LNG+miR-21 inhibitors组图6 各组细胞PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT表达

3 讨 论

PTEN是PI3K/AKT通路的上游信号分子,是一种与肿瘤细胞生长、增殖、黏附等恶性生物学相关的抑癌基因〔12,13〕。在妇科恶性肿瘤中,PTEN与子宫内膜癌关系密切,PTEN的缺失会削弱其对肿瘤细胞生长的调控作用〔14〕。已有研究指出,PTEN通过调节PI3K/AKT信号转导通路,调节细胞生长,抑制肿瘤〔15〕。因此PTEN作为一种新的抑癌基因,其独特的作用方式可以为肿瘤的基因治疗和新开发的抗肿瘤药物提供新的靶点。本研究结果支持LNG联合miR-21-5p inhibitor治疗对子宫内膜癌等相关癌症的治疗作用的理论研究,为子宫内膜癌提供了新的治疗策略。

miRNA以互补配对的方式与靶基因3'UTR区结合,降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA的翻译,从而影响肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移,已有研究表明PTEN是miR-21-5p特异性识别和结合位点〔16〕。目前,miRNA inhibitor被认为是治疗某些癌症的有前途的治疗方法,但进入临床应用的miRNA疗法数量却很少,这是因为开发miRNA有效的传递系统时遇到障碍〔17〕。而采用miRNA和其他药物的联合使用可能是一种直观的解决策略〔18〕,但miRNA联合治疗的候选药物尚在研究中,它们的协同抑制作用也需要探索。本研究成功构建miR-21-5p inhibitor并证实可以有效抑制miR-21-5p 的表达促进PTEN表达,这为后续联合治疗提供了基础。

子宫内膜癌是由激素引起的,激素治疗相对毒性低于目前的化疗和放疗等治疗方式〔19〕。孕酮的几种衍生物已被用于治疗晚期和复发性子宫内膜癌,或希望保持生育能力的患者〔20〕。LNG是目前临床上已开始用于治疗子宫内膜癌的激素,但患者的总有效率和治疗效果差异很大〔21〕。 因此有必要寻找联合或更有效的方式来治疗子宫内膜癌。

本研究发现LNG联合miR-21-5p inhibitor可以更加有效抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和转移,此过程主要是通过上调PTEN表达进而抑制PI3K/AKT通路活性。综合治疗方法是一种很有前景的子宫内膜癌治疗方法。虽然已经在体外证明了LNG联合miR-21-5p inhibitor的协同作用,但更多的数据仍需进行体内实验来进行验证。