miR-181-5p靶向PTEN/AKT/mTOR通路对氧化应激诱导下人皮肤成纤维细胞自噬及老化的影响

黄燕 杨艳清 万睿 周进飞 胡梦

(1武汉市第三医院整形外科,湖北 武汉 430060;2襄阳市伊莱美医疗美容门诊部)

人皮肤成纤维(HDF)细胞是皮肤的主要细胞类型,主要负责细胞外基质的沉积和重塑,为皮肤提供结构的完整性和弹性〔1〕。皮肤的氧化损伤是皮肤老化的主要原因之一,而氧化损伤则是由于过多的活性氧积累引起的〔2〕。另有文献报道,细胞老化与细胞自噬密切相关,自噬水平的降低可加速细胞老化,自噬水平的升高可以延缓细胞老化〔3〕。因此,从分子水平探究氧化应激诱导下HDF细胞自噬及老化的内部机制,对于延缓皮肤衰老具有重要的意义。MicroRNA(miRNA)是一类公认的转录后调节剂,属于非编码RNA家族,已通过靶向其自身的mRNAs被鉴定为调节细胞过程(如自噬、老化)的关键参与者〔4〕。研究表明,miR-181-5p参与调节细胞自噬,且是细胞老化的标志分子〔5〕。而10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路作为参与细胞自噬的主要通路之一,可调控糖尿病大鼠肾组织中自噬水平的变化〔6〕。然而,miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路对氧化应激诱导下HDF细胞自噬及老化的影响尚未见报道。本研究探讨miR-181-5p对氧化应激诱导下HDF细胞自噬及老化的影响及其内部分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞来源 HDF细胞(货号:CE19179)购于北京科瑞思搏生物科技有限公司。

1.2主要试剂与仪器 miR-181-5p模拟物(miR-181-5p mimics)及其阴性对照(miR-NC)、miR-181-5p抑制物(anti-miR-181-5p)及其阴性对照(anti-miR-NC)均购自美国Thermo Fisher公司;DMEM培养基、胎牛血清(FBS)均购自TaKaRa公司;CCK-8试剂盒、细胞衰老检测试剂盒〔β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色〕均购自美国Cell Biolabs公司;二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、Lipofectamine2000转染试剂盒均购自美国Bio-Rad公司;通用反转录试剂盒(MMLV)、SYBR Green qPCR Master Mix、双荧光素酶报告基因检测试剂盒均购自美国Promega公司;PTEN、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、自噬相关蛋白(Beclin)-1、微管相关蛋白轻链(LC)3Ⅱ/Ⅰ兔单克隆抗体、GAPDH兔多克隆抗体(anti-PTEN、anti-AKT、anti-p-AKT、anti-mTOR、anti-p-mTOR、anti-Beclin-1、anti-LC3Ⅱ/Ⅰ、anti-GAPDH)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(羊抗兔IgG-HRP二抗)均购自美国Abcam公司;荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪、CO2培养箱均购自德国Leica公司。

1.3细胞培养及细胞老化模型的构建 将HDF细胞置于含有10%FBS和100 U/ml青霉素/链霉素的DMEM培养基中,并在含有5%CO2,37 ℃培养箱中进行常规培养。参照文献〔7〕,进行细胞老化模型的构建。简言之,取对数生长期的HDF细胞,调整细胞浓度为6×103个/ml接种于96孔板中,于5%CO2,37 ℃培养箱中培养24 h。随后分别用含0、100、200、500 μmol/L H2O2的DMEM培养基培养HDF细胞24 h,最后通过细胞存活率确定构建细胞老化模型的适宜H2O2浓度,并将该浓度H2O2处理的HDF细胞命名为H2O2模型细胞。

1.4CCK-8法检测HDF细胞存活率 分别收集处于对数生长期的各组HDF细胞接种至96孔板(5×103个/孔)中,加入10 μl CCK-8溶液于每个孔中,37 ℃孵育3 h,采用全自动酶标仪测定各组细胞在450 nm波长处的吸光值(OD值)。细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

1.5细胞转染 使用Lipofectamine2000试剂盒进行细胞转染,细胞分组为:空白组(细胞未转染)、miR-181-5p mimics组(细胞转染miR-181-5p mimics)、miR-NC组(细胞转染miR-NC)、anti-miR-181-5p 组(细胞转染anti-miR-181-5p)、anti-miR-NC组(细胞转染anti-miR-NC),然后使用含适宜H2O2浓度(200 μmol/L)的DMEM培养基培养各转染组细胞24 h。

1.6qRT-PCR检测HDF细胞中miR-181-5p表达水平 用Trizol试剂分别提取各组HDF细胞总RNA,使用MMLV逆转录试剂盒将1 μg RNA逆转录成cDNA,利用SYBR Green qPCR Master Mix对miR-181-5p表达水平进行定量。以U6为内参,采用2-ΔΔCt计算基因相对表达水平。所用引物序列为:U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;miR-181-5p正向:5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTC-GG-3′;反向:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.7Western印迹检测蛋白表达水平 从细胞沉淀物中提取的蛋白质上样到12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上,然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,在5%脱脂牛奶中封闭1h后,首先将膜与一抗(anti-PTEN、anti-AKT、anti-p-AKT、anti-mTOR、anti-p-mTOR、anti-Beclin-1、anti-LC3Ⅱ/Ⅰ、anti-GAPDH)在4 ℃下孵育过夜,然后加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5 000)于室温孵育2 h。使用电化学发光(ECL)试剂可视化蛋白质,使用ImageJ软件对灰度值进行量化分析。

1.8双荧光素酶报告基因实验验证miR-181-5p与PTEN靶向关系 使用Starbase网站预测miR-181-5p与PTEN的结合位点。分别构建PTEN的野生型(WT)和突变型(MUT)3'-UTR区质粒,标记为WT-PTEN、MUT-PTEN。取对数生长期的HDF细胞,按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书将WT-PTEN、MUT-PTEN分别与miR-NC或miR-181-5p mimics共转染,转染48 h后,通过双荧光素酶测定系统分析荧光素酶相对活性。

1.9SA-β-gal活性测定 SA-β-gal活性上调是细胞老化的特征之一。按照SA-β-gal试剂盒检测各组细胞SA-β-gal的表达,老化细胞经SA-β-gal染色后会变成蓝色,在光学显微镜下计数蓝色细胞及总细胞数目,可计算SA-β-gal细胞的染色率。

1.10统计学分析 采用SPSS25.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1细胞老化模型的构建 随着H2O2浓度(0、100、200、500 μmol/L)的升高,HDF细胞存活率〔(99.96±9.96)%、(70.24±7.54)%、(51.64±5.11)%、(25.43±2.03)%〕逐渐降低,且当H2O2浓度低于200 μmol/L,细胞存活率高于50%,H2O2浓度高于500 μmol/L时,HDF细胞大量死亡。其中H2O2浓度为200 μmol/L时,细胞存活率为51.64%。因此,选择200 μmol/L H2O2作为模型的老化浓度,并将该浓度处理的HDF细胞记为H2O2模型细胞。

2.2HDF细胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相关蛋白表达 与HDF细胞相比,H2O2模型细胞中miR-181-5p及p-AKT、p-mTOR蛋白表达明显上调,PTEN蛋白表达明显下调(P<0.05)。见表1、图1。

1,2:HDF细胞、H2O2模型细胞图1 Western印迹检测HDF细胞中PTEN/AKT/mTOR 通路相关蛋白表达

表1 HDF细胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相关蛋白表达

2.3miR-181-5p靶向调控PTEN的表达 Starbase网站预测PTEN与miR-181-5p存在结合位点见图2。双荧光素酶报告基因实验结果表明,与miR-NC+WT-PTEN组(1.23±0.07)比较,miR-181-5p mimics+WT-PTEN组的荧光素酶相对活性(0.39±0.02)显著降低(P<0.05),而miR-181-5p mimics+MUT-PTEN组(1.21±0.10)与miR-NC+MUT-PTEN组荧光素酶相对活性(1.22±0.09)差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 miR-181-5p与PTEN结合位点

2.4各转染组细胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平 miR-181-5p mimics组中miR-181-5p表达水平显著高于空白组和miR-NC组(P<0.05),而anti-miR-181-5p组中miR-181-5p表达水平显著低于空白组和anti-miR-NC组(P<0.05),证明细胞转染成功。与空白组和miR-NC组比较,miR-181-5p mimics组中PTEN蛋白表达明显下调,p-AKT、p-mTOR蛋白表达明显上调(P<0.05);与空白组和anti-miR-NC组比较,anti-miR-181-5p组中PTEN蛋白表达明显上调,p-AKT、p-mTOR蛋白表达明显下调(P<0.05)。见图3、表2。

1～5:空白组、miR-NC组、miR-181-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-181-5p组;图4同图3 Western印迹检测各组PTEN/AKT/mTOR通路相关蛋白表达

表2 各组细胞中miR-181-5p、PTEN/AKT/mTOR通路相关蛋白表达及Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比较

2.5miR-181-5p对各组细胞中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响 miR-181-5p mimics组中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著低于空白组和miR-NC组(P<0.05);而anti-miR-181-5p组中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著高于空白组和anti-miR-NC组(P<0.05)。见表2、图4。

图4 各组Beclin-1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达

2.6miR-181-5p对各组细胞形态及SA-β-gal活性的影响 空白组、miR-NC组、anti-miR-NC组细胞排列不规则,细胞变大,轮廓不清楚,折光性差,符合老化细胞的特征。miR-181-5p mimics组中的细胞状态与上述类似,且比例高于空白组和miR-NC组;而anti-miR-181-5p组中大部分细胞呈长梭形,轮廓清晰,折光性好。见图5。与空白组〔(70.59±2.33)%〕和miR-NC组〔(72.09±2.09)%〕比较,miR-181-5p mimics组SA-β-gal染色率〔(95.56±6.36)%〕显著升高,而anti-miR-181-5p组SA-β-gal染色率〔(23.16±1.28)%〕显著低于空白组和anti-miR-NC组〔(71.83±2.55)%;P<0.05〕。

3 讨 论

在皮肤老化过程中,会出现皮肤变薄,皱纹增多,弹性变小等现象〔8〕。过度的氧化应激会破坏DNA和蛋白质结构,导致生物膜和细胞核的损伤,而细胞老化可以看作是氧化应激诱导损伤累积的过程〔9〕。miRNA广泛参与生物体多种生理过程,包括自噬、老化。据报道,miRNA在调节细胞增殖能力和复制性老化之间的平衡中起着至关重要的作用;一些miRNA的表达与寿命直接相关,miRNA的表达可以作为年龄,寿命和过早老化的预测因子〔10〕;miR-146a的表达水平与视网膜色素上皮细胞的衰老呈正相关〔11〕;miR-663的表达水平随年龄逐渐升高,且在老年组中的升高比率最大;miR-130a可通过调节细胞凋亡与自噬进而调控脑衰老进程;miR-181-5p在皮肤衰老的成纤维细胞中高表达〔12〕,这与本研究结果一致。本研究结果提示,过表达miR-181-5p在细胞老化过程中发挥着抑制自噬、促进细胞老化的作用,而抑制miR-181-5p具有相反作用。

为了进一步探究miR-181-5p在细胞老化过程中发挥着抑制自噬、促进老化的内部分子机制。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实PTEN为miR-181-5p的靶基因。已有研究表明,PTEN可负调控AKT/mTOR来调节自噬,PTEN/AKT/mTOR通路是参与自噬的主要信号通路之一〔13〕;在结直肠癌中,自噬标志蛋白LC3的表达与mTOR的表达呈负相关,mTOR的失活诱导了自噬的激活;非小细胞肺癌细胞自噬水平升高,而参与自噬调控的AKT/mTOR通路活性降低〔14〕。本研究结果提示,miR-181-5p可能通过靶向调控PTEN表达,进而调控AKT/mTOR通路及HDF细胞自噬,影响细胞老化。

综上,抑制miR-181-5p可能通过靶向上调PTEN蛋白表达,抑制AKT/mTOR通路,促进自噬,进而延缓H2O2诱导的HDF细胞老化。