急性慢性高尿酸血症大鼠模型的建立

张 馨 崔 娜 侯俊玲,3 王文全

(1 北京中医药大学中药学院,北京,100102; 2 廊坊爱德堡医院,廊坊,065000; 3 中药材规范化生产教育部工程研究中心,北京,100102; 4 中国医学科学院/北京协和医学院/药用植物研究所,北京,100193)

高尿酸血症是由于嘌呤代谢异常,产物产生过多和(或)排泄障碍所导致的一种代谢性疾病[1]。高尿酸血症一词在中医文献中没有明确记载,有学者认为其属“湿毒”范畴[2],从临床看,归属中医学“历节”“痛风”等范畴。

近年来,随着我国经济高速发展,我国居民的生活习惯和饮食结构已发生重大改变,高糖、高脂和高嘌呤食物摄入量显著上升。我国高尿酸血症患病率呈逐年上升、发病年龄低龄化等趋势。高尿酸血症已成为继高血脂、高血糖、高血压之后的第4大健康风险因素,即常说的“第四高”[3]。

研究表明,高尿酸血症不仅会引起痛风,也与心血管疾病、糖尿病、高血压和慢性肾脏病关系密切[4-11]。由此可见,高尿酸血症已是当前影响人类健康的一种严重疾病。近年来,中西医在治疗高尿酸血症已获得一定的成果和进展,尤其中医凭借其独特的优势,成为治疗高尿酸血症的热点。因此建立稳定的高尿酸血症动物模型,对预防高尿酸血症、筛选相关中西医治疗药物尤为重要。

目前主要通过增加嘌呤摄入、抑制尿酸排泄和基因改造等方式进行造模[12-14]。由于至今仍没有国内外统一规定和承认的造模方式,所以造模方式多种多样,评价标准也各不相同。我们通过研究4种制造急性、慢性高尿酸血症动物模型[15-16],进行多次眼眶取血,动态观察大鼠血清中的尿酸、肌酐、尿素氮等生化指标,评价各种模型的优缺点,以期为高尿酸血症模型的合理建立和应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8周龄雄性无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠72只,体质量180～220 g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,实验动物许可证证号:SYXK(京)2017-0020,动物实验伦理许可号:SLXD(京)-20210604021。大鼠饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级实验动物中心,饲养温度为(24±2)℃,相对湿度(60±10)%,采用12 h/14 h昼夜交替照明,动物自由进食和饮水。

1.1.2 药物 氧嗪酸钾(Oteracil Potassium,OAPS)(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C12677304);酵母膏(Yeast Extract,YE)(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C12434523);腺嘌呤(Adenine Phosphate,AP)(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C12642922);次黄嘌呤(Hypoxanthine,HX)(上海麦克林生化科技有限公司,批号:H811076);盐酸乙胺丁醇片(Ethambutol,EMB)(杭州民生药业有限公司,批号:T21C068)。

1.1.3 试剂与仪器 羧甲基纤维素钠(Carboxymethyl Cellulose Sodium,CMC-Na)(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C12286568);无水乙醇(北京化工厂,批号:201909412);10%中性甲醛溶液(北京索莱宝科技有限公司,20210817);生理盐水(山东华鲁制药有限公司,批号:H19010913);二甲苯(北京化工厂,批号:20190113);中性树胶(上海仪器厂,批号:201901208);苏木精染液(珠海贝索生物技术公司,批号:718072);伊红染液(珠海贝索生物技术公司,批号:718091);血尿酸、血肌酐和尿素氮测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:C012-2-1;C011-2-1;C013-2-1)。全波长扫描酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司,型号:Multiskan Mk3];恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司,型号:HW·SY11-K);分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,型号:AL204];倒置显微镜(奥林巴斯,日本,型号:IX73P1F);冷冻离心机(Eppendorf,德国,型号:Centrifuge 5430R)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1)急性高尿酸血症大鼠模型:36只SD大鼠适应性饲养7 d,按体质量分为对照组、OAPS组和HX+OAPS组,每组12只。OAPS组给予腹腔注射300 mg/kg OAPS,同时给予皮下注射生理盐水。HX+OAPS组给予腹腔注射300 mg/kg OAPS,同时给予皮下注射500 mg/kg HX。对照组同法给予腹腔和皮下注射生理盐水。大鼠腹腔注射剂量10 mL/kg,皮下注射剂量2.5 mL/kg。2)慢性高尿酸血症大鼠模型:36只SD大鼠适应性饲养7 d,按体质量分为对照组、YE+AP+OAPS组和EMB+OAPS组,每组12只,对照组每天给予灌胃5% CMC-Na溶液;YE+AP+OAPS组每天给予灌胃15 g/kg YE的5% CMC-Na溶液,2 h后灌胃100 mg/kg AP的5% CMC-Na溶液,同时在第1、3、7、11、14天给予腹腔注射300 mg/kg OAPS生理盐水溶液。EMB+OAPS组每天给予灌胃750 mg/kg OAPS和250 mg/kg EMB的5% CMC-Na混合溶液。以上各组普通饲料饲喂,正常饮水,连续饲喂2周,灌胃计量15 mL/kg,腹腔注射计量10 mL/kg。

1.2.2 检测指标与方法 1)急性高尿酸血症大鼠模型:分别在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、10 h目内眦采血0.5 mL,将血样4 ℃静置30 min,离心15 min(3 500 r/min,有效离心半径10 cm)取血清,-80 ℃冰箱放置。检测血尿酸、血肌酐、血清尿素氮活性。2)慢性高尿酸血症大鼠模型:在第14天,每组取6只大鼠肾脏进行苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,HE)染色切片;在第28天,取剩余大鼠肾脏进行HE染色切片。在第4、6、8、11、14、15、16、18、20、22、25、28天大鼠目内眦采集血液1.5 mL,血样4 ℃静置30 min,离心15 min(3 500 r/min,有效离心半径10 cm)取血清,-80 ℃冰箱放置,检测血尿酸、血肌酐、血清尿素氮水平。

2 结果

2.1 急性高尿酸血症大鼠模型

2.1.1 各组血尿酸比较 与对照组比较,OAPS组和HX+OAPS组血尿酸在造模1 h左右均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。在1～4 h间2组模型尿酸值均处于高水平,差异有统计学意义(P<0.01)。4～8 h尿酸值明显下降,OAPS组在8 h左右,尿酸已经恢复正常水平,HX+OAPS组在10 h与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组急性高尿酸血症大鼠血尿酸比较

2.1.2 各组血肌酐比较 与对照组比较,OAPS组在造模1～2 h之间血肌酐显著升高(P<0.01),4 h后恢复正常水平。HX+OAPS组在4～10 h显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组急性高尿酸血症大鼠血肌酐比较

2.1.3 各组尿素氮比较 与对照组比较,OAPS组在造模2 h尿素氮出现短暂升高情况,差异有统计学意义(P<0.05),之后恢复正常。HX+OAPS在1～10 h尿素氮均显著高于正常水平,差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组急性高尿酸血症大鼠尿素氮比较

2.2 慢性高尿酸血症大鼠模型

2.2.1 各组血尿酸比较 与对照组比较,YE+AP+OAPS组血尿酸在4～20 d明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),EMB+OAPS组在4～22 d明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 各组慢性高尿酸血症大鼠血尿酸比较

2.2.2 各组血肌酐 与对照组比较,YE+AP+OAPS组血肌酐在4～6 d升高,差异有统计学意义(P<0.01),而EMB+OAPS组在14～16 d升高,差异有统计学意义(P<0.01),且在20 d和25 d也有短暂性升高,差异有统计学意义(P<0.01)。见表5。

表5 各组慢性高尿酸血症大鼠血肌酐比较

2.2.3 各组尿素氮比较 与对照组比较,YE+AP+OAPS组尿素氮在4～16 d显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),EMB+OAPS组在11～28 d显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 各组慢性高尿酸血症大鼠尿素氮比较

2.2.4 各组慢性高尿酸血症大鼠组织病理学结果 在14 d切片中,与对照组比较,YE+AP+OAPS、EMB+OAPS组的肾脏损伤严重。损伤主要在肾小管,肾小管扩张严重,肾小管大面积管形,肾小管体积粗大,上皮变薄,空腔面积数倍增大并且空腔,在肾小管周围存在炎症细胞浸润,肾组织纤维化。28 d切片中可以看出,YE+AP+OAPS组肾脏损伤有所恢复,表现在炎症细胞和空腔结构的减少上,而EMB+OAPS组肾脏损伤并未有明显改变。见图1。

图1 大鼠肾脏组织病理结果(HE染色,×100)

3 讨论

尿酸是人嘌呤代谢的最终产物,主要通过肝脏、肾脏和肠道循环排出体外。高尿酸血症多发生在灵长类动物中,是因为编码尿酸氧化酶的基因失活,无法将尿酸进一步转化成尿囊素从而导致尿酸在人体内的增加。高尿酸血症的发生主要有2种途径,生成过多和排泄障碍。基础研究证实,90%的高尿酸血症均由尿酸排泄减少所致,排泄障碍主要是指肾小管对尿酸的重吸收出现障碍,导致血尿酸水平异常升高,临床上表现为肌酐和尿素氮的升高。中医认为高尿酸血症病位在于脾肾,其病因为七情内伤、外感六淫、饮食不节等[16],亦提示“肾”与高尿酸血症有密切关系。因此认为,肾损伤可能是高尿酸血症发生的重要原因。

随着高尿酸血症日益受到重视,找到一个稳定性好、重复性好的高尿酸血症动物模型成为各项研究的重点,然而目前高尿酸血症动物模型的诱导方法仍然存在周期长、稳定性差等问题。急性高尿酸血症发作是当人体在一次性摄入过多高嘌呤物质,而体内未能及时将其代谢,会出现血尿酸的急性升高及轻微的肾损伤[17-18]。所以造模时也是采用让动物体内尿酸一次性剧烈升高的方式。但是急性模型方法为单次造模,可观察预防性给药的疗效,无法观察治疗性用药的疗效。目前常用的方法是一次性腹腔注射OAPS[19],方式单一,而且存在重复性不好的问题。本研究针对大鼠,通过将HX与OAPS联合造模,与单一采用OAPS造模进行对比,以期筛选出有效稳定的急性模型。结果显示,2种方法在造模后都显著提高了尿酸水平,但是OAPS组高尿酸水平维持时间较短,而HX+OAPS组10 h时仍然维持在高水平。OAPS组出现了血肌酐和尿素氮短暂性升高,而HX+OAPS组同样显示出了更长时间的高水平。以上可以看出HX+OAPS组相比OAPS组高尿酸血症症状维持时间长,作为急性预防模型有着更加明显和稳定的高尿酸水平升高和肾脏损伤,更加适用于中西医预防性药物的筛选。

对于慢性高尿酸血症模型造模机制，主要在于尿酸的长期积累从而导致其他疾病发生，尤其是肾脏疾病[20-22]。综合之前学者的研究，选取了YE+AP+OAPS和EMB+OAPS这2种方式，造模给药14 d后继续观察14 d，观察模型维持情况[23-24]。结果显示，2种模型均显著提高了尿酸水平，停止给造模剂后可以维持1周左右时间，EMB+OAPS组维持时间更长。血肌酐和尿素氮结合病理切片结果显示2种造模方式均出现肾脏损伤，YE+AP+OAPS组在停止造模后肾损伤情况有所改善，而EMB+OAPS组肾脏损伤更加严重，在停止给造模药物2周后各项指标仍处于高水平。综上所述，2种14 d的造模方式都可以显著提高尿酸水平并伴有明显的肾脏损伤，而且在停止造模后1周仍维持原来的高尿酸血症病理状态。说明14 d的造模方法可取，可以缩短造模时间但是没有影响造模效果，一定程度上可以节约时间和成本费用。EMB+OAPS组比YE+AP+OAPS组高尿酸血症病理状态更明显维持的时间更长在治疗高尿酸血症药物筛选上EMB+OAPS造模方法更优于YE+AP+OAPS造模方法。

综上所述,实验中的造模方法操作简单且实用性强,为中西医治疗高尿酸血症药物的开发提供了评价工具及基础的造模数据。

利益冲突声明:无。