和胃安神方对失眠模型大鼠5-羟色胺、多巴胺及去甲肾上腺素水平的影响

黎发根 王 亮 李绍旦 杨明会 周建平 刘 毅

(1 解放军总医院第六医学中心中医医学部,北京,100853; 2 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,北京,100850)

失眠症是以频繁而持续地入睡困难和(或)睡眠维持困难并导致睡眠感不满意为特征的睡眠障碍[1],是临床上常见的一种睡眠障碍性疾病,发生率高,长期的失眠会严重影响人们的身心健康[2-4]。目前西医对失眠的治疗以镇静催眠药物为主,而长期应用这类药物不良反应较多,且治疗效果不理想[5-6]。在既往研究中应用和胃安神法中药治疗失眠症取得良好临床疗效[7],但其作用机制尚不清楚。本研究应用失眠大鼠模型,通过观察下丘脑中5-羟色胺(5-hydroxytryptamin,5-HT)、多巴胺(Dopamine,DA)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)水平的变化,进一步探讨和胃安神方治疗失眠症的可能疗效机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级Wistar健康雄性大鼠50只,体质量(200±20)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物合格证号:SCXK京2019-0003。提前1周将大鼠饲养在12 h光照(7:00～19:00)、12 h黑暗(19:00～7:00)的安静环境下,自由饮水摄食,室温保持(24±2)℃,相对湿度40%～50%。所有实验流程均经解放军总医院医学伦理委员会批准(伦理审批号:SCXK-2019-057)。

1.1.2 药物 和胃安神方由半夏10 g、薏苡仁15 g、陈皮15 g、茯苓15 g、石菖蒲10 g、合欢皮10 g、炒枣仁15 g、夜交藤15 g组成,所有饮片均经解放军总医院中药房提供并鉴定。将上述诸药按传统煎药法文火煎30 min,以恒温水浴锅浓缩成含生药1.05 g/mL的药液,由玻璃瓶密闭盛装,4 ℃冰箱保存备用。地西泮片(天津力生制药股份有限公司,批号:H12020119)。

1.1.3 试剂与仪器 对氯苯丙氨酸(4-Chloro-DLphenylalanine,PCPA)(Sigma公司,美国,批号:C6506);5-HT、DA、NE的酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunoadsordent Assay,ELISA)检测试剂盒(北京新亚太生物科技有限公司,货号分别为:10004310,10009127,30001020)。MORRIS水迷宫视频分析系统(上海软隆科技发展有限公司,型号:BW-BW-MWM101);高速冷冻离心机(北京京立离心机有限公司,型号:LGR20-W)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 通过随机数字表将60只大鼠分为6组,即正常对照组、失眠模型组、地西泮组、和胃安神方低剂量组、和胃安神方中剂量组、和胃安神方高剂量组,每组10只。采用对氯苯丙氨酸(Para-Chloro-DL-phenylalanine,PCPA)诱导失眠模型。除正常对照组外,其余组大鼠参照文献[8]并结合预实验结果,按300 mg/kg体质量以10 mL/kg于每天上午8:00～8:30进行PCPA腹腔注射,1次/d,连续2 d。于第1次腹腔注射28～30 h后,大鼠出现昼夜节律消失,白天活动不停,整体观察与正常对照组有明显不同,表明模型复制成功[9]。

1.2.2 给药方法 于第3天开始每天上午8:00进行灌胃给药,按大鼠每公斤体质量用药量为成人(60 kg)每公斤体质量用药量的6倍换算,作为和胃安神方中剂量组(10.5 g/kg),和胃安神方高剂量组和和胃安神方低剂量组分别为中剂量的2倍(21 g/kg)和0.5倍(5.25 g/kg),和胃安神方各剂量组每天给予对应中药水煎液10 mL/kg。地西泮组给予相同体积92 mg/L地西泮水溶液,地西泮片按成人催眠剂量10 mg/d,用人与大鼠给药剂量体表面积折算计算出大鼠给药剂量为0.92 mg/(kg·d)。正常对照组、失眠模型组给予相同体积的生理盐水,1次/d,连续灌胃6 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 行为学观察 实验期间每日观察并记录各组大鼠毛发、饮食、活动及睡眠情况。

1.2.3.2 学习记忆能力测定 应用Morris水迷宫实验进行大鼠学习记忆力测定[10]。Morris水迷宫直径120 cm,高50 cm,水池内壁为白色,将圆桶分为1、2、3、4共4个象限,分别设置4个入水点,将直径10 cm,高20 cm的白色圆柱形平台随机置于某一象限正中。实验时,水面高出平台约1.5 cm,水中加入二氧化钛,使其呈乳白色不透明状,水温控制在(20±2)℃。测试过程中水迷宫周围的参照物均保持不变,实验者的位置也保持相对固定,并保持环境安静,光线适度。造模前先对各组大鼠进行Morris水迷宫训练3 d,并记录训练成绩。实验后立即将大鼠置于水迷宫观察各组大鼠的定位航行能力及空间搜索能力。主要观察指标:潜伏期,即大鼠从入水到找到平台的时间。

1.2.3.3 下丘脑5-HT、DA、NE检测 于末次给药24 h后,将大鼠脱颈处死,迅速断头取脑,分离下丘脑,充分匀浆后低温离心,离心机在4 ℃以8 000 r/min,离心10 min,离心半径8.2 cm,取上清液,于-20 ℃保存待测。采用ELISA法检测大鼠5-HT、DA、NE的水平,按试剂盒说明操作。

2 结果

2.1 大鼠行为学变化 失眠模型组、地西泮组及和胃安神方各剂量组连续2 d腹腔注射PCPA后,大鼠毛发杂乱,无光泽,昼夜节律消失,白天活动不停,容易激惹,进食、饮水增多,睡眠减少直至消失,与正常对照组有明显差异。随着灌胃天数增加,和胃安神方各剂量组及地西泮组大鼠的上述表现均有不同程度的改善,其中和胃安神方高剂量组、和胃安神方中剂量组改善明显,治疗至第6天时,昼夜节律已基本恢复。

2.2 学习记忆力测定 各组大鼠实验前Morris水迷宫训练的平均潜伏期差异均无统计学意义(均P>0.05),实验后各组大鼠测试潜伏期均较实验前缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。与失眠模型组比较,和胃安神方低剂量组和地西泮组测试潜伏期与失眠模型组比较差异均无统计学意义(均P>0.05);和胃安神方中剂量组、高剂量组测试潜伏期均较失眠模型组显著缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 实验前后大鼠水迷宫测试潜伏期比较

2.3 各组大鼠下丘脑5-HT、DA、NE水平比较 失眠模型组大鼠5-HT水平较正常对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),DA、NE水平较正常对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);和胃安神方低剂量组和地西泮组5-HT、DA、NE水平与失眠模型组比较差异均无统计学意义(均P>0.05);和胃安神方中剂量组、和胃安神方高剂量组5-HT水平均较失眠模型组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),DA、NE水平较失眠模型组均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠下丘脑5-HT、DA、NE水平比较

3 讨论

随着生活和工作的节奏加快,人们的社会压力明显增加,失眠发生率呈逐年上升的趋势[11-12]。多年的理论研究及临床实践发现,原发性失眠与“胃”密切相关,失眠的基础在于“胃”[13]。早在《黄帝内经》中就有“胃不和则卧不安”的记载,且中医理论关于失眠的学说如“阴阳说”“神主说”“营卫说”“气血说”等都与“胃”密切相关[14]。一则因为胃乃人体阴阳升降之枢纽,二则因为“胃”乃“水谷气血之海”,是“后天之本、营卫之源”,而“神者,水谷之精气也”。胃气调和、升降有序,则气血化生有源,营卫循其常度,阴阳自和,而神安夜眠,故“胃和”则“寐安”。而现代生活方式和饮食结构习惯的变化,常常引起人体脾胃、肠道的消化功能紊乱,即“胃不和”。因此针对原发性失眠者的“胃不和”采用和胃安神方以治之。既往的临床研究证实其对失眠症的治疗效果良好[7,15],但其疗效机制尚不明确。

和胃安神方由半夏、薏苡仁、炒枣仁、石菖蒲、茯苓、夜交藤、合欢皮、陈皮组成。其中半夏燥湿化痰、降逆止呕,可“除腹胀,目不得眠”,薏苡仁健脾益胃、渗湿利水,二者合用,取半夏秫米汤和胃安神之意。炒枣仁宁心安神,石菖蒲开窍宁神,茯苓健脾宁心,夜交藤养心安神,合欢皮解郁宁心,佐以陈皮健脾化痰、调中和胃,诸药合用,共奏和胃安神之功。

5-HT是睡眠调节最为重要的神经递质之一[16],其对慢波睡眠的发生及维持起着重要的作用,是能够促进睡眠的神经递质[17]。有研究者在鼠和猫身上分别给予PCPA后慢波睡眠显著减少,而给予小剂量的5-HT后睡眠则修复[18]。DA是脑内含量最多的兴奋性神经递质之一,具有维持觉醒和行为兴奋的作用[19]。NE也是一种公认的参与觉醒的单胺类神经递质,其释放量增加可引起交感神经系统活性增强,导致睡眠-觉醒紊乱,释放量的减少则可促进睡眠[20-21]。

本研究采用国际公认的PCPA腹腔注射诱导的失眠大鼠模型,其结果显示,失眠模型组大鼠下丘脑5-HT水平显著下降,DA、NE水平显著升高,和胃安神方中剂量组、和胃安神方高剂量组治疗后5-HT水平明显高于模型组,DA、NE水平明显低于模型组,且大鼠睡眠节律得以恢复,学习记忆力得以改善。本研究结果提示,对5-HT、DA、NE等神经递质的调节作用可能是和胃安神方治疗失眠的内在机制之一。对于和胃安神方调节此类神经递质的具体途径和作用机制,还有待深入研究。

利益冲突声明:无。