针刺疗法对子宫内膜异位症大鼠细胞凋亡的影响

韩亚光 宋思钰 孙小惠 韩延华 朱小琳

(1 黑龙江中医药大学附属第一医院,哈尔滨,150040; 2 黑龙江中医药大学,哈尔滨,150040;3 黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨,150001)

子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)指正常脱落的子宫内膜上皮细胞种植在腹壁、卵巢等位置,常见于育龄期妇女,主要临床表现为下腹痛、不孕、性交痛。该病发病率逐年上升,达10%～20%[1],不孕妇女中发病率更高,严重影响患者身心健康。目前其发病机制尚不清楚,雌激素依赖性疾病、炎症性疾病是对EMs的统一认识[2]。西医治疗EMs主要是以激素和手术为主,但不良反应大或有创伤性损伤[3]。近年来中医疗法在治疗EMs等慢性疾病中被广泛认可,针刺治疗灵活、不良反应少,深受EMs患者青睐,越来越多的研究表明针刺能够缓解EMs疼痛、抑制异位组织血管生成和侵袭黏附、调节免疫功能及内分泌,改善相关症状[4-8]。本课题组探究其疗效及作用机制,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取6周龄未孕健康Sprague-Dawley(SD)清洁级雌性大鼠47只,体质量190～210 g,由黑龙江中医药大学动物实验中心提供,动物合格证号:SCXK(黑)20180004。实验大鼠饲养于黑龙江中医药大学妇科实验室,日常保持饲舍温度(23±2)℃,湿度(55±5)%,自然采光,对实验动物采用自由饮水和采食。所有实验均遵守黑龙江省中医药大学动物伦理研究委员会发布的伦理指南(伦理审批号:GLWJ-ZD-019)。

1.1.2 器具 毫针:贵州安迪牌针灸针,规格为0.25 mm×40 mm,贵州安迪药械有限公司产。改良后使用。

1.1.3 试剂与仪器 原位末端凋亡法(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)细胞凋亡原位检测试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司,货号:40308ES20);兔抗鼠磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)试剂盒(CST公司,美国,货号:4249);蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)(CST公司,美国,货号:4691);哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)试剂盒(CST公司,美国,货号:2983);兔抗胱天白酶-3(Caspase-3)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号:201901029);Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号:20190118);B细胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma 2,Bcl-2)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号:20190302);核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司,货号:DP430];反转录试剂盒(Vazyme公司,货号:R211-01);荧光定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)试剂盒(Qiagen公司,美国,货号:208054)。冰冻切片机(德国徕卡公司,德国,型号:RM2135);光学显微镜(NIKON公司,日本,型号:Eclipse ci);多功能酶标仪(Tecan公司,瑞士,型号Infinite F50);实时荧光定量PCR仪(ABI公司,美国,型号:7500);荧光倒置显微镜(德国蔡司公司,德国,型号:Axio型);电泳仪(Bio-rad公司,美国,型号:042BR13724)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将47只SD大鼠分为2组，对照组12只，35只造模。造模过程中死亡9只，最后造模成功24只。将造模成功的24只大鼠，按随机数字表法分为模型组和针刺组，每组12只。

实验动物经适应性饲养1周后,采用自体子宫内膜组织移植于肠系膜的建模方法[9-11],建立EMs大鼠模型。术前24 h皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.1 mL/kg,使所有实验动物在造模前统一处于动情期[12]。腹腔1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)注射麻醉,麻醉成功后,开腹找到子宫,在右侧子宫剪下长约1 cm的子宫组织,行远端结扎包埋术,剥离剪下的子宫组织,切成3 mm×3 mm小组织片,选择0～4号肠线将组织片缝到靠近腹部内膜层的肠系膜上,使子宫组织的内膜层面向肠系膜,检查是否存在肠管损伤或者出血现象,确定均无此现象后,用可吸收的2-0线将切开逐层缝合,腹腔注射青霉素8 IU∶0.25 mL,用碘伏消毒缝合处。在术后的前3 d,每天给大鼠肌内注射青霉素。常规饲养4周,观察大鼠进食、活动状态、大小便情况。对照组前期准备工作同造模大鼠,切除子宫组织后仅用可吸收的4-0线在肠系膜缝合,并未将子宫组织片缝合到肠系膜上,余处理同造模大鼠。手术在黑龙江中医药大学中医妇科实验动物中心动物房内,严格按照无菌操作规范进行。

造模4周后行开腹观察异位囊肿变化情况作为造模是否成功的初步判断,再进行苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色,若见内膜上皮细胞、腺体和间质细胞即为造模成功。将造模成功的大鼠,再次逐层缝合,均肌内注射青霉素8 IU∶0.25 mL,连续3 d。

1.2.2 干预方法 采取以下治疗方案:对照组及模型组,无特殊干预,正常清洁饲养。模型组:造模成功后,正常清洁饲养,无特殊干预。针刺组:每日9时,在清醒状态下,将大鼠固定在手术固定台,用32#针,选取大鼠腹部关元穴(脐下25 mm)、中极穴(脐下34 mm)和双侧子宫穴(卵巢解剖部位)以5～8 mm深度进针,另取双侧三阴交穴(后肢内踝尖直上10 mm)以4～5 mm深度进针,且刺入即刻和留针10 min时分别施提插捻转手法30 s,留针30 min/次,1次/d,连续28 d。

1.2.3 检测指标与方法

治疗第28天,对3组大鼠禁食12 h后,称重,在大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg),麻醉成功后对大鼠心脏采血。将采血管充分摇匀后,放于低温离心机,在4 ℃,离心半径8 cm,4 000 r/min离心15 min,将上层血清用移液器分装到0.5 mL的EP管中,存放于-20 ℃冰箱中待用。

无菌手术条件下,开腹取在位内膜、异位内膜组织,截取长度1 cm。将取出的造模区域和子宫组织浸泡到灭菌的生理盐水,将组织表面血液、脂肪、血管等清洗剥离干净。用小手术剪,将组织样品剪成5 mm×5 mm小组织块,取1/4浸泡于10%甲醛溶液中,1/4浸泡于OCT(Opti-mum Cutting Temperature Compound)包埋剂中,剩余的组织块保存于冻存管中,用液氮速冻后,保存于-80 ℃的超低温冰箱中待用。

1.2.3.1 HE染色观察在位、异位内膜组织病理形态 取浸泡于10%甲醛溶液的子宫内膜组织,经梯度乙醇脱水,二甲苯透明、石蜡液包埋、切片、苏木精染色、伊红染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片,倒置光学显微镜下观察子宫组织形态并拍照。

1.2.3.2 TUNEL检测在位、异位内膜组织细胞凋亡 浸泡于OCT包埋剂的样品放置于预冷样品盘。切片机作5 μm切片,采用丙酮浸泡、烘干、磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)清洗、蛋白酶K溶液浸泡、PBS清洗、过氧化氢(Hydrogen Peroxide,H2O2)溶液浸泡、PBS清洗、脱氧核糖核酸酶I(DNase I)溶液浸泡、PBS冲洗后。再将滴加50 μL的末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase,TdTase)反应液,暗盒37 ℃避光反应60 min(加盖盖玻片),PBS反复清洗。加入50 μL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)反应液,暗盒中37 ℃条件避光反应15 min(加盖盖玻片),用PBS反复清洗。荧光显微镜对切片拍照和分析。

1.2.3.3 实时荧光定量PCR检测在位、异位内膜组织雌激素受体α(Estrogen Receptor α,ER-α)、雌激素受体β(Estrogen Receptor β,ER-β)、PI3K、AKT、mTOR、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表达 取样品,采用研磨法提取信使RNA(Messenger RNA,mRNA),测定总RNA浓度,按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为互补脱氧核糖核酸(Complementary DNA,cDNA),按PCR试剂盒进行扩增,在PCR仪上进行检验,结果以GAPDH为内参,2-△△Ct法分析相对mRNA表达量。见表1。

表1 各基因引物系列

1.2.3.4 蛋白质印迹法检测在位、异位内膜组织ER-α、ER-β、PI3K、AKT、mTOR、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白含量 大鼠内膜组织加裂解液冷冻匀浆后,以4 ℃,离心半径8 cm,12 000 r/min离心10 min,上清液经二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法检测蛋白浓度。上样量为20 μL,电泳条件100 V,90 min,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,冰上转膜,加入1抗,孵育过夜,清洗,加入2抗,孵育,清洗,进行ECL显影、曝光及扫描,采用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值,以GAPDH为内参,对目的蛋白进行半定量分析。

2 结果

2.1 针刺对大鼠在位、异位内膜组织病理学的影响 病理切片结果发现,异位内膜组织中,对照组子宫内膜上皮细胞排列紧密多为柱状,腺体结构清晰,腺体结构完整;模型组可见细胞核排列紊乱,腺体结构不完整,有明显异位增生和炎症介质浸润;针刺组异位内膜组织形态分布规律趋于正常,异位增生和炎症介质浸润明显缓解。见图1。

图1 3组大鼠在位与异位内膜组织病理学变化(HE染色,×200)

2.2 针刺对大鼠在位、异位内膜组织的细胞凋亡的影响 与模型组比较,针刺组在位细胞凋亡无明显增加,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和模型组异位组织细胞凋亡现象较少,而针刺组细胞凋亡显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 3组大鼠细胞凋亡变化(DAPI染色,×200)

2.3 针刺对大鼠在位、异位内膜组织ER-α和ER-β基因表达的影响 3组大鼠在位内膜组织中,ER-α和ER-β基因相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。3组大鼠异位内膜组织中,模型组ER-α和ER-β基因相对表达量显著高于对照组和针刺组,差异均有统计学意义(均P<0.05);针刺组ER-α和ER-β基因相对表达量显著高于在位内膜组织的针刺组,差异有统计学意义(P<0.05),ER-β基因相对表达量显著高于异位内膜组织的对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。在基因表达方面,在位内膜组织3组ER-β/ER-α差异无统计学意义(P>0.05);模型组异位内膜组织ER-β/ER-α显著高于(P<0.05)对照组和针刺组(P<0.05),也显著高于在位内膜组织模型组,差异有统计学意义(P<0.05);而针刺组ER-β/ER-α虽然高于对照组,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组雌激素受体基因表达变化

2.4 针刺对大鼠在位、异位内膜组织ER-α和ER-β蛋白含量的影响 3组大鼠的在位内膜组织中,ER-α和ER-β蛋白含量差异均无统计学意义(均P>0.05)。3组大鼠的异位内膜组织中,模型组ER-α和ER-β蛋白含量显著高于对照组和针刺组,差异有统计学意义(P<0.05);针刺组ER-β和ER-β/ER-α蛋白含量显著高于在位内膜组织针刺组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组在位内膜组织的ER-β/ER-α差异无统计学意义(P>0.05);模型组异位内膜组织ER-β/ER-α显著高于对照组和针刺组,差异均有统计学意义(均P<0.05),也显著高于在位内膜组织模型组,差异有统计学意义(P<0.05);针刺组的ER-β/ER-α显著高于对照组和在位内膜组织模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 3组雌激素受体ER-α和ER-β蛋白含量变化

2.5 针刺对大鼠在位、异位内膜组织PI3K/AKT/mTOR基因表达的影响 3组大鼠在位内膜组织中,PI3K、AKT和mTOR基因表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。3组大鼠异位内膜组织中,模型组PI3K、AKT和mTOR基因表达显著高于对照组和针刺组,差异有统计学意义(P<0.05);干预后,针刺组PI3K、AKT和mTOR基因表达低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。对异位内膜及在位内膜组织比较,异位内膜对照组和模型组PI3K、AKT和mTOR基因表达与在位内膜差异无统计学意义(P>0.05),异位内膜针刺组显著低于在位内膜。见表4。

表4 3组PI3K/AKT/mTOR通路基因表达变化

2.6 针刺对大鼠在位、异位内膜组织PI3K/AKT/mTOR通路蛋白含量的影响 3组大鼠在位内膜组织中,PI3K、AKT和mTOR蛋白含量差异均无统计学意义(均P>0.05)。在大鼠的异位内膜组织中,模型组PI3K、AKT和mTOR蛋白含量显著高于对照组和针刺组,差异均有统计学意义(均P<0.05),并且mTOR蛋白含量显著高于在位模型组,差异有统计学意义(P>0.05);针刺组PI3K、AKT和mTOR蛋白含量显著低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。异位对照组PI3K和AKT蛋白含量显著低于在位对照组,差异有统计学意义(P<0.05),mTOR蛋白含量显著高于在位对照组,差异有统计学意义(P<0.05);异位针刺组PI3K和AKT蛋白含量显著低于在位对照组。3组大鼠在位内膜组织和异位内膜组织PI3K、AKT、mTOR蛋白含量的变化趋势与PI3K、AKT、mTOR基因表达量相一致。见表5。

表5 3组PI3K/AKT/mTOR蛋白表达变化

2.7 针刺对大鼠在位、异位内膜组织Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表达的影响 3组大鼠在位内膜组织中,Caspase-3、Bax和Bcl-2基因相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。干预后,3组大鼠异位内膜组织中,针刺组Caspase-3和Bax基因相对表达量显著高于对照组和模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05),Bcl-2基因相对表达量显著低于对照组和模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。对针刺组在位内膜和异位内膜Caspase-3、Bax和Bcl-2基因相对表达量比较，发现异位内膜针刺组的Caspase-3和Bax基因相对表达量显著高于在位内膜针刺组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，异位内膜针刺组Bcl-2基因相对表达量显著低于在位内膜针刺组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 3组大鼠凋亡相关因子基因表达变化

2.8 针刺对大鼠在位、异位内膜组织Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白含量的影响 3组大鼠在位内膜组织Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。3组大鼠异位内膜组织模型组Caspase-3和Bax蛋白含量有高于对照组趋势,Bcl-2蛋白含量有低于对照组趋势,但差异无统计意义(P>0.05);干预后,针刺组Caspase-3和Bax蛋白含量显著高于对照组和模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05)，Bcl-2蛋白含量显著低于对照组和模型组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。异位内膜针刺组Caspase-3和Bax蛋白含量显著高于在位内膜针刺组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，而异位内膜针刺组Bcl-2蛋白含量显著低于在位内膜针刺组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表7。

表7 3组大鼠凋亡相关因子蛋白含量变化

3 讨论

EMs是指脱落的子宫内膜细胞种植于子宫体腔以外的其他部位,具有较高发病率和复发率,是女性极为常见的良性慢性雌激素依赖性疾病[13-16];又因其具有浸润生长、远处转移,可侵犯和损害周围组织等恶性肿瘤的生物学行为,也被称为是“不死亡的癌症”。其发病机制尚不明确,目前存在多种观点和理论,都具有一定说服力。“经血逆流学说”认为脱落的子宫内膜组织随经血逆流入卵巢或盆腹腔其他组织,种植生长[17-18]。而郎景和教授[19]的“在位内膜决定论”指出个体在位内膜的特性才是决定异位内膜能否逆流并转移、种植的关键,EMs的发生进展可分为“黏附-侵袭-血管生成”3阶段。本课题组前期研究通过基因芯片技术对差异表达基因进行筛查,发现在异位内膜组织中存在异位内膜细胞凋亡减弱现象[20],现为验证及探究其深层作用机制开展研究。

凋亡是一种死亡机制,细胞通过基因调控死亡,使细胞进行更新迭代[21],此过程是维持细胞和组织稳态的关键机制,因此促进异位组织细胞凋亡对EMs的治疗至关重要。影响凋亡的相关蛋白分2类,一类是抗凋亡蛋白,如Bcl-2;一类为促凋亡蛋白,如Caspase-3、Bax,这3种凋亡因子在EMs研究较多。而PI3K/AKT/mTOR信号通路、核因子κB信号通路是影响凋亡的上游通路。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是细胞内非常重要的信号转导通路,参与子宫内膜的黏附、侵袭、血管形成以及细胞凋亡等过程,而PI3K/AKT/mTOR信号通路和雌激素调控在此过程中发挥着至关重要的作用[22-23]。研究发现EMs患者体内雌激素相关受体比正常对照组明显升高,尤其是雌激素受体-β[24]。ER-β被认为具有抗增殖和促凋亡作用,高水平的ER-β通过诱导环氧合酶2的合成从而刺激组织细胞中前列腺素产生并与相应受体结合,激活AKT通路,使PI3K/AKT/mTOR信号通路调控作用异常,影响细胞的凋亡、迁移和自噬等,促进EMs发生、发展[24]。而针刺治疗可以下调在位及异位内膜组织中ER-β表达,使其趋于正常子宫内膜水平,达到治疗大鼠EMs的效应[25];还能通过诱导基因释放与转导、细胞因子及细胞内小分子释放和传递等对细胞凋亡产生影响[26-27]。因此基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探究针刺疗法治疗EMs的作用机制理论上是可行的。

中医学注重整体观念与辨证论治的相统一,在治疗EMs上尤其注重整体调整机体内环境及微稳态,针刺作为中医整体观念的具体体现,在辨证选穴的基础上,直接作用于病变位置,充分发挥“直达病所”的优势。选取关元、中极、子宫、三阴交等穴以活血化瘀,散结止痛。EMs病位在胞宫,与冲任二脉关系密切,其中关元、中极、子宫穴同居小腹,关元为小肠经募穴,统治足三阴、小肠、任脉诸经病,具有补肾壮阳、温通经络、理气和血、补虚益损等作用[28],古今均作为保健要穴;中极通于胞宫具有补气行气活血、调理冲任的作用;子宫属经脉奇穴,为妇科要穴之一,主治月经不调、痛经等;三阴交为足三阴经交会穴,主治生殖系统疾病,能够具通调冲任,缓急止痛。研究发现针刺通过影响中枢神经系统的疼痛感觉机制,镇静止痛,从而达到治疗EMs痛经的目的,且针刺腹部腧穴能降低异位内膜的活性,促进异位内膜萎缩[29]。目前研究多从针刺阵痛、抑制“黏附、侵袭、血管生成”和雌激素代谢等方向研究治疗EMs,但作用机制尚不明确[30]。

本研究结果显示,与对照组比较,模型组大鼠异位内膜组织细胞核排列紊乱,腺体结构不完整,有明显异位增生和炎症介质浸润,雌激素受体α、ER-β表达升高,符合EMs特征。而针刺治疗后,模型组异位组织抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达明显升高,大鼠异位增生和炎症介质浸润得到缓解,异位组织凋亡明显增加,表明针刺治疗能够上调凋亡因子的表达,促进异位组织凋亡。针刺治疗前后雌激素受体和PI3K/AKT/mTOR信号通路基因表达和蛋白含量的变化,提示针刺的治疗作用可能是通过调控了体内ER-β水平,进而影响了PI3K/AKT/mTOR信号通路促进病灶细胞凋亡。

本实验研究针刺对子宫内膜异位症大鼠细胞凋亡及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响,为针刺治疗子宫内膜异位症机制研究提供了新思路。

利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突关系。